И.Ф. Жимулёв - Общая и молекулярная генетика (1117666), страница 50
Текст из файла (страница 50)
Пример использования Саузерн-блота для картирования точки разрыва инверсии на карте ДНК представлен на рис. 7.24. Литература «разделу 7.4.5 ИвквеП Р. !. Оеиес1сз. 5« ей. Меи!и Раг1с, Са(йопйа: Айсйвои 9Уез1еу Еоиищаи !ис., !998. Р. 471, Хромосомная ДНК Исходный клип Шаг ! — аыдслсннс рскомбинавтных клонов а- Ф й» 3 ) ~В~ ~яе- Шаг 2 — выделение рскомбинаитных клонов д-ж и тек Схема «хромосомной ходьбы».
Объяснения в тексте ДНК исходной ДНК лии1ис из линии бсв инверсии с иа репей 7.4.6. «Хромосомная ходьбам Процесс клонирования с помощью метода так называемой «хромосомной ходьбы» (зуа!- Ыпя), предложенного в 1979 г. В. Бендером, П. Спирером и Д. Хогнессом ( 1«'. Вепс1ег, Р. Бр(егег, 12. Нокпезз), позволяет получать длинные фрагменты (тракты) ДНК. Для начала «ходьбы» нужен специфический зонд, т. е. фрагмент ДНК из данного района хромосомы: это может быть ДНК гена или ДНК Р-элемента при условии, что вследствие его инсерции в клонируемом гене индуцирована мутация.
«Ходьб໠†- это процесс идентификации прилежащих клонов в геномной библиотеке. Процесс «ходьбы» включает следующие этапы: 1) получение исходного зонда; 2) поиск в геномных библиотеках; 3) выделение клона и построение рестрикционной карты; 4) выделение нового зонда и новый поиск в библиотеках. Исходный клон ДНК должен быть каким-то способом получен. Меченый концевой кусок этого клона (1 на рис. 7.25) используют для скринирования библиотеки, сделанной на основе 2-фага или космид, и отбирают все рекомбинантные фаги.
Как правило, отбирается несколько фагов (а-с на рис. 7.25). Поэтому, чтобы задать нужное направление движения при «ходьбе», все полученные клоны проверяют на наличие гомологии с одним из ближайших к концу фрагментов -- 1' и отбирают только те рекомбинантные фаги, которые содержат клоны, гибридизующиеся с концевым фрагментом 1, но не с фрагментом 1'. Отобранный 167 Гтпнп ?. СТРУКТУРА ГЕНА клон г гибридизуют 01 .тйи с хромосомами, чтооы удостовериться, что он в геноме располагается в том же месте, что и исходный клон. Затем строят рестрикционную карту клона г и вновь отбирают два концевых фрагмента --- 2 и 2'. Используя этот клон как зонд, скринируют библиотеку. Из вновь полученных клонов отбирают только те, которые не имеют гомологии с фрагментом 2', т. е. клон т).
Затем все повторяют с фрагментами 3 и 3' и т. д. С помощью иходьбы» клонируют протяженные участки хромосомной ДНК. Известен случай, когда из генома дрозофилы клонировалн до 800 тпн. Из ограничений метода можно указать на огромные сложности клонирования в случае, если ДНК зонда содержит участок, гомологичный повтору, разбросанному по геному. При этом можно первый шаг сделать в одном участке хромосомы, а второй уже в другом — там, где локализована данная повторенная ДНК.
Другим ограничением является небольшая длина каждого шага. Канве!! Р. Л. Оепебсв. 5в ей Меп!и Рвгк, Са!!Гогйв: Аййван Фев!еу Еопйтпап !ис., 1998. Р. 473. Метод, похожий на Саузерн-блот, но применяющийся для анализа РНК, называется Нозерн-блотом (Ног!)тегп-Ыо!).
Он был разработан в ! 977 г. Д. Олвином, Д. Кемпом и Д. Старком (1. А1ту(пе, 13. Кешр, О, 8!аг(с). В данном случае молекулы РНК, выделенные нз клетки, разделяются по размерам с помощью гельэлектрофореза, затем переносятся на фильтр. После гибридизации с меченым одноцепочечным зондом выявляются сигналы в определенной области электрофореграммы, в которой обнаружена гомологпя РНК и ДНК зонда. Используя маркеры молекулярной массы, можно определить размер транскрипта какого-то гена. Применяют Нозерн-блот в следующих типах экспериментов: 1) для определения размера специфических мРНК, кодируемых данным геном; 2) для выяснения того, присутствуют лн в данном типе клеток мРНК, считанные с данного гена, т.
е, экспрессируется ген или нет; 3) для определения количества этой РНК и его изменения в развитии данного типа клеток. Рнвд "денис цнпсй и присоединение црвймсра Удпин ннс првймврв, образование второй цспн Цикл 1 Цикл 2 Цикл 3 ит, д. Питература к разделу 7.4.7 Кцвве!! Р. Л. Оенебсв. 5н ей Меп!о Райс, Св!!!отн1в: Аййвоп %ев!еу Еопрпап !ас., !998. Р. 473. Питерагпура к разделу 7.4.6 7 4.7.
Нозерн-блот анализ 7.4.8. Полимеразная цепная реакция Размножить определенный небольшой участок генома можно с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) (рис. 7.26), который был изобретен в 1983 г. К. Мюллисом. Исходную молекулу ДНК прогревают, чтобы разрушить водородные связи, соединяющие комплементарные цепи. Затем реакционную смесь охлаждают в присутствии двух коротких (12-20 пн) фрагментов ДНК, один из которых комплементарен участку ДНК слева от изучаемого локуса, а второй -- участку другой нити справа от изучаемого локуса. Эти фрагменты, называемые праймерами, связываются с соответствунзщигни участками ДНК и задают точку начала синтеза новой комплементарной нити на матрице ДНК.
Осуществляет этот синтез фермент ДНК-полимераза. В следующем цикле реакционную смесь с полученными нитями ДНК снова прогревают и вновь синтезированные нити ДНК используют в качестве матрицы. Новая порция праймеров связывается с соответствующими участками, и происходит новый цикл синтеза.
В живой клетке ДНК-полнмераза осуществляет редупликацию ДНК при делении клетки, т. е. полностью воспроизводит геномную ДНК. Прн проведении ПЦР синтезируется только небольшой фрагмент, расположенный между двумя праймерами. За 30 циклов число синтезированных фрагментов составит около 1 млрд. Схема поднмеразной цепной реакции [Мц!!1в, 1990. Р б4) 168 ОБЩАЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГН(ЕТИКА Контроль Образны ДИК из костных останков Старт пы йж й \!~ У- 112 пн Х вЂ” 106 пн ва — фрагменты анализируемой ДНК. Слева— две дорожки с контрольными образцами: фрагментами, синтезированными на геномной ДНК, выделенной из крови мужчины и женщины.
У мужчин образуется два фрагмента: длиной 112 пн, соответствующий гену амелогенина в У-хромосоме, и 106 пн, соответствующий этому же гену в Х-хромосоме. У женщин имеется две Х-хромосомы, каждая из которых дает фрагмент 106 пн. В исследованных девяти образцах в 4 случаях видны две полосы, а в 5 —. одна полоса.
Следовательно, среди убитых было 4 мужчины и 5 женщин. Именно столько женщин было в царской семье, расстрелянной в Екатеринбурге в июле 1918 г. [Янковский, 1996!. Смесь прогревают при 94-95 'С, а охлаждают при 60 'С; эти температуры слишком высоки для того, чтобы обычная ДНК-полимераза нормально работала.
Поэтому используют особый фермент (Тад-ДНК-полимераза), выделенный из бактерий Тлегтпз пвиа!псих, которые живут в горячих источниках. Метод ПЦР лежит в основе процедур идентификации личности, установления родства людей, в судебной медицине. Так, при расследовании убийства семьи последнего российского царя была использована ДНК из костных останков 9 человек в количествах, измеряемых ничтожными долями грамма: примерно по 20 пикограммов. Столько ДНК содержится примерно в 1О клетках.
Определение половой принадлежности по ДНК основано на том, что половые Х- и Ухромосомы человека несут гомологичный ген, находящийся в них в двух аллельных состояниях. Этот ген кодирует компонент зубной эмали— амелогенин, в Ухромосоме он на 6 пн длиннее, чем в Х-хромосоме. Для того чтобы выявить, содержится ли в данном образце ДНК У-хромосомы, из всей геномной ДНК анализировали лишь область амелогенинового гена, содержащую участок, различный в Х- и У-хромосомах.
Размер этой области составляет одну тридцатимиллионную долю от всего генома. Для определения размера полученных ПЦР- фрагментов их разделяют с помощью электрофореза в агарозном геле. На рис. 7.27 показаны результаты такого разделения фрагментов гена амелогенина после проведения ПЦР на ДНК из костных останков. На девяти дорожках спра- Литература и разделу 7.4.8 Иванов П.
Л. Молекулярно-геиетическая индивидуализация человека: Автореф. дис.... д-ра биол. наук. М., 1995. Янковский Н. К. Молекулярно-генетические методы в руках детектива, или опыт исследования останков семьи последнего российского императора Д Соросовский образовательный журн.
1996. № 2. С. 21-27. Мв!йз К. В. Т1зс пппьаа! ог(8!и оГ(йс ро!уюсгазс сЬа!и гсасйоп П Бс!. Аюсг. 1990. Арп(. Р. 56 — 65. Впьяе!1 Р. !. Оспсйсз. 5ь с6. Мсп1о Раг1с, Са!(Гога!а; Аоо! аоп '1уез!еу 1 оп8юап ! пс., ! 998. Р. 476-478. 7.4.9. Определение последовательности нуклеотидов (секвенирование) В 70-х гг. были разработаны две методики определения последовательностей нуклеотидов в клонированных фрагментах ДНК. Одну предложили А. Максам (А. Махагп) и У. Гилберт (%. П(!Ьег(), другую — — Ф.
Сэнгер (Р. Бапяег). Метод Сэнгера, используемый чаще, будет рассмотрен ниже. В 1993 г, К. Б. Мюллис (К. В. Мп!!Ра) получил Нобелевскую премию за разработку метала полнмсразиой цепной реакции. Определение половой принадлежности по анализу ДНК из костных останков !Янковский, 1996. С, 24), Объяснения в тексте Гяава ?. СТРУКТУРА ГЕНА 169 Рвлноаксивный олигоиухлеотид- ный нрвймер лоетрвилветел ДПК-полимерввой Анализируемая последовательность Реакция йй ййА 5 ййАА А й Сс СС тт ййЛ Л т 0 3 ййл АА ййСс Сс С С т Л йй Фрагменты ДНК Намврв нуклеотидов 168 2 549 5!С! т т т т ай А ййо ййс ййт е Ие „а с е ы е о' Последовательностям 5 А-0-С-С-Т-А-б-А-С-Т3 Схема опыта по определению последов;псль- ности пуклеотидов !Каяле!1, 1998, Р.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
