И.Ф. Жимулёв - Общая и молекулярная генетика (1117666), страница 46
Текст из файла (страница 46)
И.„Акифьев А. П„Черпни Л. С. Общая генетика. Мх Высш. шк., 1985. С. 239-252. Льюин Б. ! сны. Мх Мир„!987. С. 176-201. 151 Гзоеи 7. СТРУКТУРА ГЕНА Старт транскрипции в -50 -411 -30 -20 -!О ! !О 20 30 Связывание РНК-полимеразы е промотором .'ас Инду«тор Оператор Структурны- гены Промотор б ДНК 3 Направление транскрипции Сайг Сей г посадки Сайг ~нзсадки СЛР РНК-позимеразы репрессора Оператор «выключена е 3 'САР еАМР 1'Н1г" Рсцрсссор нолнчераза Оператор «вклгочси» "::- ЯЯфвзвз 3' мрнк 5 Неактивный рспрсссор-индукторный комплекс Тоанспоотный Транеацстидаза белок !5-! алактозндаза Функционирование лактозного оперона у Е сей: и — локализация сайтов связывания молекул РНК-лолимеразы и рспрессора в регуляторной области гена !асХ !Еезс1л, 1994. Р. 417]; б — структура лактозного опероиа !как и у всех генов, регулируемых САР и сАМР, промотор содержит два района: участок связывания с РНК-полимеразой и участок связывания с комплексом САР-сАМР1; е — нег пивная, ." — позитивная регуляция !ас-оперона [б —.
— Спгг!з, Ваглез, 1989. Р. 3251. В отсутствие лактозы репрессор (продукт гена !асей связывается с оператором. Хотя РНК-полнмераза может связываться с промотором, она не перемещается далее рспрессора. Оператор выключен, гены не работают. В присутствии лактозы репрессор инактивируется и более не связывается с оператором. Молекулы РНК-полимеразы перемещаются, и начинается транскрипция Ратнер В. А.
Что содержит полный геном Езсйег!сй!и со07 0 Соросовский образовательный журн. 2002. В1а!!пег Р. В., Р!вийей Оч В!осЬ С. ет а!. ТЬе согор!еге 8епопзе зедиепсе оГ Езс!!ег!сййг со0 К-12 0 Яс1епсе. 1997. Чо1. 277. Р. 1453 — 1462. Вгеппег Я. А п)8М а! 1Ье орегон 0 Ыа!пге. 1997. Чо!. 386. Р. 235. Снгтн Н., Вагпея 74. Я. Вю!ойу. 5а ег!.
Ыезс Уог1с %оггЬ РпЫВЬегз 1пс., !989. Р. 320 — 326. $.етв1п В. Оепев Ч. Охуогд; Ыеж Уогй; То1суо: ОхГого 1!пгкегя!гу Ргезз, !994. Р. 4!3-432. 1.еж1п В. Оепсв Ч1!. ОхГогд„Ь1езс Чог!н Охрого 13п1- теггй!у Ргезз, 2000. Р. 273 — 3 ! 8. Впмей Р. Оепейсз. 5'" ей. Меп!о Райс, Са!!!низ!а: Абгйаоп %еа1еу Еопрпап 1пс., 1998.
Р. 50! — 534. +2! Связывание репрсссора с оцсрагором /ас т ОБЩАЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА Литература к разделу 7.3 7.4. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ Т.З. ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ГЕНОВ Известно несколько способов получения генов: 1. Непосредственное выделение нз природных источников 1клонирование). 2. Химический синтез.
3. Копирование соответствующей гену мРНК для получения комплементарной ДНК- реплики 1кДНК). Искусственный синтез гена был впервые осуществлен химическим путем в 1969 г. Г. Хораной н его сотрудниками. Группа Хораны синтезировала ген аланиновой тРНК дрожжей, структура которого к тому времени была полностью расшифрована. Ген длиной 77 пн не содержал регуляторных последовательностей н поэтому не обладал функциональной активностью.
Позднее та же группа авторов синтезировала первый функционально активный ген— ген супрессорной тирозиновой тРНК Е соЛ длиной около 200 пн. Искусственно синтезированные гены могут экспрессироваться в составе гибридных молекул микроорганизмов. Первой удачной попыткой такого рода стала работа К. Итакуры и Г. Бойера с соавторами 11977) по экспрессии в Е. сой гена, коднрующего гормон млекопитающих — соматостатин. Ген соматостатина был получен на основе сведений о первичном строении этого пептидного гормона, состоящего всего из 14 аминокислот.
В различных лабораториях были созданы штаммы Е. сой, продуцируюшие гормон роста человека — соматотропин, пептидные гормоны брадикинин и ангиотензин, нейропептид лей-энкефалин, интерферон. Ген гормона роста человека, имеющий размер 584 пн, — наиоолее длинный из искусственно синтезированных в настоящее время. Он был встроен в плазмиду, реплицирующуюся в Е.
сой под контролем промотора триптофанового оперона. Трансформированные полученной химерной плазмидой клетки Е. сой продуцировали при индукции промотора около 3 млн молекул гормона роста человека в рас- Процесс молекулярного клонирования„илн избирательного накопления идентичных молекул ДНК, состоит из нескольких этапов: фрагментация ДНК путем обработки эндонуклеазой рестрикции, объединение этих фрагментов )л лгго с векторной молекулой ДНК (способной к автономной репликации), введение век- чете на клетку. Этот полипептид, как было установлено в экспериментах на крысах с удаленным гипофизом, по функциям оказался полностью идентичен гормону роста человека.
Ген инсулина синтезировали в виде более чем 40 шестичленных олигонуклеотндов, которые затем обьединяли с помошью ДНК-лигазы. Полученные двухцепочечные полинуклеотиды длиной 271 и 286 пн были встроены в плазмиды. Туда же были включены регуляторные участки ДНК, обеспечивающие экспрессию гибридных молекул. Клонированные гены кодировали синтез проинсулина, который путем несложной химической обработки можно превратить в активный гормон. состоящий из двух полнпептидных цепей А и В длиной 21 и 30 аминокислотных остатков, соединенных между собой днсульфидными связями. Используется также метод искусственного получения генов, основанный на их ферментативном синтезе с помощью механизма обратной транскрипции.
Этот механизм связан с активностью РНК-зависимой ДНК-полимеразы, или обратной транскриптазы 1ревертазы),-- фермента, впервые обнаруженного при исследовании репликации РНК онкогенных вирусов. Фермент способен строить копии ДНК на разных РНК, вклнзчая синтетические полирибонуклеотиды. С помощью ревертазы можно синтезировать практически любой ген в присутствии соответствующих мРНК, методы выделения которых достаточно хорошо разработаны. Данный метод удобно применять для генов, исключительно интенсивно транскрибируемых в определенной ткани. Таким способом получены и клонированы гены, кодирующие глобины человека, других млекопитающих и птиц, белок хрусталика глаза быка, яичный белок, фиброин шелка и некоторые другие 1'Алиханян и др., 19851.
Алихаияи С. И., Акифьев А. П., Черняв Л. С. Общая генетика. Мл Высш. шк., 1985. С. 415 — 418. тора в реципиентский организм, в котором и происходит накопление рекомбинантных ДНК. Формальной датой рождения генной инженерии считают 1972 г., когда группа П. Берга в США создала первую рекомбинантную ДНК ги 141го, объединившую в своем составе генетический материал из трех источников: пол- Сгсгв«?. СТРУКТУРА ГЕ11А ве«п! в н! з АТОСЙА('АТТССАТА ТАСОС»Т)ТАсА»Сгб ТАТ в А'А1ТТС С АТА ТАССгСТ)ТАгь ООТАТ ггаепг ТТСАЯ СА ААЙТС СгА я г ПСА ОСА АЛСгТ СОА Последовательность иуклеотидов, содержащая сайты, распознаваемые различными рестриктазами [Алихаггягг и др., !985.
С. 415] 7.4.'1. Ферменты рестрикции В 1978 г. В. Арбер (Угг. АгЬег), Д. Натане ((г, Ыагйаля) и Х. Смит (Р!. йпггЬ) получили Нобелевскую премию за открытие ферментов рестрикции и их применение в молекулярной генетике. ный геном онкогенного вируса обезьян ЯУ40, часть генома умеренного бактериофага 2 и ген лактозного оперона Е. сой. Сконструированная рекомбинантная молекула не была исследована на функциональную активность, поскольку у авторов возникли опасения, что методы генной инженерии могут привести к появлению микроорганизмов, опасных для здоровья человека, например бактерий Е.
со!1, способных перенести онкогенные вирусы животных в кишечник человека. Функционально активные молекулы гибридной ДНК были впервые получены С. Коэном, Д. Хелински, Г. Бойером и их сотрудниками в 1972 †19 гг. В 1962 г. В. Арбер показал, что в бактериях действуют специальные ферменты, способные специфично отличать свою (бактериальную) ДНК от чужой (фаговой). Эти ферменты рестрицируют (т.
е, ограничивают) возможность размножения фаговой ДНК в бактериях путем ее более или менее специфичной деградации. Такие ферменты были названы эндонуклеазами рестрикции, или рестриктазами. Естественной функцией рестриктаз является защита бактерии от инфекции вирусами. ДНК в сайтах рестрикции у самой бактерии модифицирована метилированием, так что фермент рестрикции не может расщеплять свою собственную ДНК. Однако вирусная ДНК не защищена метильными группами, и ферменты расщепляют ее.
Первая рестриктаза, специфично расщепляющая двухцепочечную ДНК в строго определенных сайтах, была выделена Х. Смитом и его сотрудниками в 1970 г. из штамма Паетор)гг1их 1и11иеллае. Она была обозначена Итс)Н1. Известны три класса рестриктаз, различающихся между собой по характеру узнавания и разрыва ДНК, структуре белка и условиям, необходимым для осуществления реакции. В генно-инженерных работах используют фер- менты второго класса, разрывающие двухцепочечную ДНК в зоне участка узнавания.
Обычно фермент распознает специфичную последовательность из 4-6 пн, являюгцуюся палиндромом, и разрезает ее в середине или несколько в стороне. В последнем случае образуются выступающие одноцепочечные концы, получившие название «липких». Такие концы, сформировавшиеся под действием одной и той же рестриктазы, могут гибридизоваться между собой в силу комплементарности оснований. Это обеспечивает возможность последующего объединения различных молекул ДНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
