И.Ф. Жимулёв - Общая и молекулярная генетика (1117666), страница 47
Текст из файла (страница 47)
Примером рестриктаз, образующих «липкие» концы, являются широко используемые в генно-инженерных работах ферменты ЕсоИ и ВатН1. Первая из них кодируется Я-плазмидой, присутствующей в штамме Е. со!1, вторая обнаружена в клетках Васс!1ах сгту1о1г9ае)ассеггж Примером рестриктаз, образующих полностью двунитевые («тупые») концы, служит Оае1П, выделенная из штамма Пастор)г11ггв аееурггггт (рис. 7.6).
Ферменты рестрикции обозначают по названию организма, из которого онн изолированы. Используют три буквы из названия вида бактерии, например, Вл1П вЂ” из Вас!Пах е1обге1, Есо(П вЂ” из Е. со!1, Е(тгПН вЂ” из Оаетор)гг1ггв глугггеллсге. После трех букв курсивом следуют определенный буквенный символ, обозначающий генетическую линию или штамм, и римская цифра. В настоящее время известно более 400 рестриктаз, способных расщеплять ДНК в общей сложности почти по 120 различающимся последовательностям. 154 ОБЩАЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНГТИКА 37итература к разделу 7.4.1 Виги1Н Линейная плвзмидв пВВ322 В !Нт" я Яи' Г' В»Щ Фрагменты кловнруемой ДНК В~оин! ВатН! ВшиН1 Випн! ВигиН1 ВасиН! сииН1 и Воги111 Схема встраивания клонпруемых фрагментов ДНК в плазмнлу рВВЗ22 Среди эукариот специфические эндонуклеазы обнаружены у дрожжей родов ВассЬаготусея и Р(сЫа.
Алихвнян С. И.„Аквфьев А. !1., Черним Л. С. Общая генетика. Мс Нысш. шк., 1985. С. 4!3— 415. Нивке!! Р. й. Оепебсв. 5и еб. Меп!о Раг1с, Св! Ноппа: Абс(!воп Фез!еу Еопвшап!пс,, ! 998. Р. 448-452. 7 4.2. Векторы для молекулярного клонирования Вектор — — это молекула ДНК, переносящая клонируемый фрагмент ДНК. Любой вектор должен обеспечивать стабильное наследование рекомбинантных ДНК в автономном состоянии. Кроме того, вектор может иметь дополнительные характеристики, облегчающие генно- инженерные процедуры, например, содержать маркер, инактивирующийся прн встройке в него чужеродной ДНК. Векторные системы для молекулярного клонирования обычно создаются на основе репликонов плазмид и бактериофагов.
7.4.2.1. Плазмидные векторы Птазмида, используемая в качестве вектора при клонировании в бактериальной клетке, должна включать следующие элементы: 1) сайт ог! (участок инициации репликации) для нормальной репликации ДНК и размножения плазмиды в клетке данного вида бактерий; 2) доминантный селективный маркер, который позволяет отобрать клетку, несущую плазмиду со встроенным фрагментом чужеродной ДНК; 3) уникальный сайт ресгрикции, т. е. встречающийся в векторе единственный раз. Хорошо известные плазмидные векторы (РВВ322 и р(7С9) ведут свое начало от небольшой плазмиды Со(Е1, реплицирующейся в клетках Е. сод независимо от хромосомы и существующей в числе 10--20 копий на клетку.
В определенных условиях выращивания бактерий можно добиться избирательной амплифнкации этих плазмид, в результате чего онн образуют до 1000 копий на клетку. Плазмида РВВ322 имеет гены устойчивости к антибиотикам ампициллину (АР') и тетрациклину (Тс"). В гене Тс" имеется уникальный сайт, разрезаемый рестриктазой ВатН1 (рис. 7.7). Глони 7. СТРУКТУРА ГЕ11А 1'' Алшициялнн Трвнсформвци» ° .
Посев пк чанжн Петри -:...935;;:, Тстрнциклин д гид Алшициялин Посев гы ляшки Петри Тстр,щиклин Т1звнсфо1змвция гс в В сил Схема выявления нлазмид, содержащих встройку клоцнруемых фршчкентов ДНК. А. Встройкв фрвгментв Ф в ген Пс" нарушает его активность. и бактерия теряет устойчивость к тетрвциклину. После трансформации клеток Е. гий плазмидвми и последовательного посева этих бактерий на газон с влпшциллином и тстрвциклююм колонии образуются только у трансформантов, имскзщг1х плазмиду.
Если клонирусмый фрвгмент встроился в ген Тсй этн колонии (31 будут отсутствовать на среде с тстрвцикзином. Бактерии иэ колонии 3 с вмпициллинового газона собирают для опытов. Б Одинаковое расположение колоний нв обоих газонах свидетельствует об отсутствии всгройки чужеродной ДНК в плвзмнду После обработки ДНК плазмиды рестриктазой ВатН! получается линейная ДНК, имеющая специфичные «липкие» концы. Ее смешивают с фрагментами клонируемой ДНК (обработанной также ВатН1), имеющими те же «липкиен концы. Отжиг и обработка ДНК- лигазой приводит к образованию плазмиды, содержащей встройку чужеродной ДНК, причем максимальный размер встройки ДНК в зту плазмиду составляет 1О тпн.
Как и сам процесс встраивания фрагмента в плазмиду, так и трансформация плазмиды в Е. соВ являются процессами статистическими, в результате которых могут образоваться три типа клеток: не содержащие плазмиду, содержащие плазмиду без встройки, содержащие плазмиду со встройкой. Чтобы выбрать клетки, несущие плазмиды со встроенными последовательностями ДНК, используют специальную схему (рис. 7.3).
Широко используется в качестве вектора плазмида рВ!пеяспр! П КЯ(чэ'-). Эта кольцевая молекула, имеющая длину 29б1 пн, создана на основе другой плазмиды --- р(уС!9. У плазми- ды рВ!незсгрз! (рис. 7.9) число копий достигает 100 на клетку, селекционным маркером является ген резистентности к ампициллииу (Ар'), она содержит целый ряд уникальных сайтов рестрикции, собранных в одном районе. Такие участки называют полилинкерными или участками множественного клонирования (пш!Нр1е с!оп!пц з!(е, МСЯ). В плазмиде рВ!пекет!рг участок МСВ длиной около 200 пн содержит до 20 сайгон рестрикции и расположен в районе 5'-конца гена !асс., Плазмиды культивируют в клетках с мутантным проявлением гена )асс,.
Поэтому нормальная активность данного гена достигается за счет работы его в плазмиде. В результате инсерции чужеродной ДНК в полилинкер нарушается работа гена !асс. и в плазмиде. Колонии бактерий, содержащих нормальный и мутантный гены. легко различаются, если поместить клетки на субстрат Х-ца!, который разрушается Р-галактозидазой (продукт гена !ас2) с выпадением нерастворимого в воде осадка, окрашенного в синий цвет. Клетки. в которых произошла трансформация плазмидой, отбирают по их способности 156 ОБ!ЦАЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА Хае1 130 5яр1 19 Вяр! 2Б50 Вяр! 441 МИ 530 5си! 2526, ф';...;:"-' " Рыи1 500 ф1~ РыиП 529 ВяяН 11 619 5«с1 657 (Грп! 759 В яН 11 792 Рмя! 24!6 рл!иеяспр! П КБ +!- Рыи Н 977 ы Нлазмила рВ!я«ясар!!! КБ (+I — ) жить на среде с ампициллином.
Те клетки, которые содержат плазмиды со встроенной ДНК, образуют неокрашенные колонии. Если колонии окрашены в синий цвет, значит, в этих клетках плазмиды не содержат встройки. Бактериальные искусственные хромосомы (ВАС вЂ” Ьас!епа! ап!11с(а! сЬго)позоше) приготовлены на основе Е-плазмиды Е. соВ 1ВЬ(ануа е! а!., 1992!. Эта плазмида (рис. 7.!О) имеет гены, которые контролируют не только репликацию ее ДНК, но и число копий в клетке. Регуляторные гены включают ог!В, герЕ (контроль однонаправленности репликации Е-фактора), рагА и рагВ (поддержание числа копий на уровне 1--2 на клетку Е.
соВ). Кроме того, в плазмиде есть гены резистентности к хлорамфениколу (Ст") и сегмент клонирования. Последний включает сайты бактериофагов 2сояХ и Р11охР (эти два сайта дают возможность получения концов, используемых для построения рестрикционных карт), два сайта инсерции (Оок1111 и ВатН!), а также несколько С-Г(-богатых сайтов рестрикции (.Уог(, ЕаВ1, Хта1, Вша1, Вд!1 и о!11).
Размер клонируемого фрагмента составляет около 300 тпн. Наличие колоний клеток, содержащих инсерцию, определяется по гибридизации на фильтрах с клонируемой ДНК. Плазмиды иногда встречаются у эукариот, однако большинство из них не проявляется в фенотипе и обнаруживается только с помощью молекулярных методов. Наиболее известно так называемое 2-микронное кольцо (2и-с!гс1е) у дрожжей. Эту плазмиду также можно использовать в качестве вектора при клонировании (см. разд. 8.3.2.2). Для переноса генов используют также плазмиды почвенных бактерий: П-плазмиду АдгоЬас!ег!ит !итфтасЯеля и В(-плазмиду АВгоЬисяегшт гЬ!гояелея. Эти бактерии поражают до 60 56 двудольных растений и некоторые однодольные растения, вызывая формирование опухолей — корончатых галлов (А.
!плит«гас!егм) или образование «косматых корней» (А. гЬ!еоВелея). Трансформирующими факторами у этих бактерий являются большие плаз- 157 Гаааа 7 СТРУКТУРА ГЕНА Л)ва! ! Яюа! №п! 7 ВК)1 ~ ог !! Л!о!! 7 Еая! 1охР Нйк!1!1 2!а~нН! промотор Т оромооор оро Вас! совы 5аЛ о'ас! гаРЕ Строение плазмиды р8АС!Ооь' (оо!аоуа е! а!., ! 992) миды — 2) (от англ. 1~ипог шйпгйпй) или И (гоо! !пбпс!пд). П-плазмида — это кольцевая ДНК, аналогичная плазмиде Р(7С19, ио отличающаяся от нее гигантскими размерами (примерно 200 тпн против 2,69 тпн у РИ.'"/9). Она содержит ориджин репликации, Т-область (Т-- (гапз!ег), которая выделяется из плазмиды и переносится в ядро клетки, два повтора длиной по 25 пн, называемых левой и правой ().В и КВ) границами Т-области, район т'1К (у1го1епсе), содержащий шесть генов, контролирующих процесс встраивания Т-области в геном хозяина, и ряд других генов (рис.
7.11). Для успешного встраивания трансгена в геном хозяина необходим только участок, расположенный между повторами ).В и КВ, и все остальные функции остаются в собственно плазмиде. Поэтому механизм трансформации оказался довольно простым, и на основе П-плазмиды создано много различных векторов. В качестве селективных маркеров в Т-область вводят гены устойчивости к антибиотикам (канамицину, карбенициллину) или гербицидам. При взаимодействии инфицирующей бактерии с поврежденным участком растения индуцируется ЪЧВ-область, в результате активности которой появляются одноцепочечные надрезы в пределах пограничных областей плазмиды, сначала в правой (КВ), затем - — в левой ().В).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
