И.Ф. Жимулёв - Общая и молекулярная генетика (1117666), страница 51
Текст из файла (страница 51)
474) ДНК денатурируют до однонитчатого состояния щелочной обработкой или нагреванием. Затем отжигают с одной из нитей короткий олигонуклеотидный праймер (рис. 7.28). Олигонуклеотид синтезируется таким образом, чтобы его 3'-конец был последним перед секвенируемой последовательностью. Олигонуклеотид служит праймером для достраивания цепи ДНК-полнмеразой. Для каждого эксперимента по секвенированию ставят четыре реакции с однонитчатой ДНК и прикрепленным к ней праймером. Каждая реакционная смесь содержит четыре нор- 10 9 Х 7 0 6 5 4 н 1 А А А 000 ййС С С ййС С т Л с» Л ййС АА Сс ся С С С С ййТ Т А (с А С ййТ мальных предшественника ДНК: с!ЛТР, ЙТТР, йСТР и йОТР, а также ДНК-полимеразу !чаще используют ДНК-полимеразу фага Т7).
Предшественники метятся радиоактивно изотопами '-Р, "Р или "В или нерадиоактивно. Реакции различаются присутствием того или иного модифицированного основания, называемого дидезоксинуклеотидом. поскольку у этих нуклеотидов в 3'-позиции находится Н, а не ОН, как у дезоксинуклеотидов. Дидезоксинуклеотид может включаться в растущую цепь ДНК, однако на этом синтез останавливается, поскольку отсутствие 3'-ОН предотвращает образование фосфодиэфирной связи с последующим нуклеотидом. В каждой реакционной смеси присутствуют 4 нормальных й!к!ТР и по одному с!й!с!ТР, в соотношении примерно 100; !.
Таким образом, ДНК растет от праймера до того момента, когда в одну из позиций встраивается дндезоксинуклеотид. Поэтому среди продуктов реакции будет множество фрагментов, различающихся по длине, так как синтез их начинается с фиксированной точки (от праймера), а кончается в положении одного из нуклеотидов, соответствующих дидезоксинуклеотиду. В электрофорезе они разделяются,и последовательность легко определяется (см. рис, 7.28). Литература к разделу 7.4.9 Нияяе11 Р. й. Ссепейся.
5ь ей. Меп!о Райс, СаИогпса: Айй!яоп %ея1еу Еопрпап 1пс., 1998. Р. 473 — 476. 7.4.10. Трансформация у дрозофилы Трансформацией в генетике называют перенос генов из одного организма в другой. Трансформации у прокариот посвящен разд. 5.11. У эукариот трансформация в природе до сих пор не обнаружена. Что же касается экспериментальной передачи ДНК из одной клетки в другую, то на протяжении многих лет она у исследователей не получалась. Многие группы ученых азартно конкурировали друг с другом в конце 70-х — начале 80-х гг., пытаясь первыми осуществить перенос ДНК. Успехи были весьма редкими: молекулы ДНК, инъецированные микрохирургически в ранние эмбрионы некоторых видов млекопитающих, амфибий, морских ежей, иногда встраиваются в хромосомы клетки-хозяина.
У дрозофилы искусственно введенная ДНК почти не включается в хромосомы эмбриона, хотя в культуре клеток типичная трансформация 1или, как говорят, трансфекция) происходит довольно часто. Однако очевидно, что из такой клетки трудно получить целый организм, и трансформированная ДНК не может передаваться потомству. 170 ОБЩАЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕ(!ЕТИКА Джеральд Рубин (р.
1950) Аллан Снрадлинг (р. 1949) Поколения Р[иу М) л-рл25.7ис О0 Отбор >у Т Изолинии Локализаник аетроск Анализ ДНК В конце концов повезло двум американским исследователям Дж. Рубину и А. Спрадлингу (рис. 7.29, 7.30) в 1982 г. В качестве вектора они использовали мобильный Р-элемент. Для осуществления транспозиции у Р-элемента присутствуют специальные структуры— концевые повторы — — по 150 пн определенной последовательности на каждом конце элемента. Именно с этими участками связывается транспозаза и катализирует процесс встраивания — вырезания Р-элемента.
Таким образом, для перемещения Р-элемента нужно, чтобы были выполнены два условия: наличие у него неповрежденных концевых повторов и нормальная активность транспозазы. Если будет нарушен какой-либо из экзонов гена транспозазы или во время транскрипции и созревания матричной РНК транспозазы не будет удален один из интронов, полноценный фермент не получится и Р-элемент не будет перемещаться. Однако недостаток транспозазы из одного Р-элемента может быть легко компенсирован, если в геноме присутствует еще один Р-элемент, нормальный, который и обеспечит наличие этого фермента. С учетом всего перечисленного эксперимент по трансформации у дрозофилы схематически выглядит следующим образом (рис. 7.3! ): готовят ДНК двух Р-элементов, один из которых — — рл25.7игс — — может синтезировать транспозазу, но не способен встраиваться в геном, так как у него поврежден один из концевых (с 3'-конца) повторов„в то время как во втором Р-элементе --- Р[(~у")А1 ---- удалена значительная часть гена транспозазы, но он может перемещаться по геному, поскольку имеет нормальные концевые повторы.
В Р-элемент Р[(гу')А1, являющийся вектором и имеющий дефектный ген транспоза- Микроинъскция .а ка < ллл Ф < гу' Или гу нлн Отбор гз да а лл О1 Р[(гун)4); лу ' или ~у' илн Схема скрещиваний для осуществления трансформации у дрозофилы [Бргад!1нд, 1986. Р. 177) Гли«и 7. СТРУКТУРА ГЕ!.!А !7! зы, обычно встраивают дополнительный фрагмент ДНК длиной до 20 тпн, который хотят трансформировать в геном дрозофилы. Р-элемент Р((гу')А'! называют транспозоном, а Рж25.7и с --- элементом-хелпером или помощником. Затем смесь этих двух типов ДНК инъецируют в эмбрион дрозофилы.
Там некоторая ее часть встраивается в ДНК полярных клеток, из которых позднее образуются клетки зародышевого пути. Таким образом чужеродная ДНК, инъецированная в эмбрион на ранних стадиях развития, передается следующим поколениям потомков. Многие факторы, в том числе и размер встроенного в Р-элемент фрагмента чужеродной ДНК, влияют на успех трансформации; в среднем только около 14 'Ъ эмбрионов развиваются в плодовитое потомство. Поэтому встает вопрос о том, как различить мух, у которых инъецированная ДНК встроилась в геном, и мух без встройки. Для этого в Р-элемент Р((гу')А! вводят специальные маркерные гены.
Это могут быть либо гены дрозофилы, контролирующие окраску глаз, например ген голу, гены дрозофнлы, кодирующие синтез ферментов, например алкогольдегидрогеназы, или даже ген, выделенный нз генома медузы н кодирующий белок ОГР, обнаруживающий при определенных условиях зеленую флуоресценцию. Разберем сначала схему, в которой используется ген гику (см. рис. 7.31). В этом случае в Р-элемент Р1(гу )А'! введен фрагмент ДНК, содержащий нормальный аллель гена ьтму (гу"). ДНК этого транспозона вместе с ДНК хелпера инъецируют в эмбрионы, гомозиготные по мутации гпяу — !у'О6.
Если транспозон Р((гу')А] встроился в геном, то в поколении О! будут мухи с нормальным цветом глаз, поскольку у них — - гомозигот по мутации ! у"' — — появится ДНК с нормальным аллелем гу' в транспозоне. Недавно в транспозон в качестве маркера стали вводить кДНК гена ГРРР, подшитую к подходящему промотору.
В случае ннсерции транспозона в различных клетках дрозофилы синтезируется белок ОГР. В результате облучения этих клеток длинноволновыь! ультрафиолетовым светом белок ОГР начинает флуоресцировать зеленым светом. С какими целями используют трансформацию в экспериментальной генетике'? Можно выделить несколько направлений. 1. В процессе клонирования и выделения генов всегда остается вопрос о том, весь ли ген уже в руках экспериментатора, т.
е, полностью ли выделены его регуляторная и структурная части. Для выяснения этого в состав транспо- зона вводят фрагмент ДНК, предположительно содержащий ген, --. это фрагмент А в транспозоне Р[(О")А) (см. рис, 7.31). Затем хромосому со встроенным транспозоном Р((гэ')А1 путем скрещивания вводят мухам, гомозиготным по мутации испытуемого гена. Если в транспозоне присутствуют все части гена А, необходимые для его функционирования, то такая особь будет иметь нормальный фенотип, поскольку действие мутантного аллеля А полностью перекрывается нормальным аллелем А', расположенным в транспозоне.
Происходит «спасение» (гезспе) мутантного фенотипа — — формируется нормальный. Нетрудно заметить. что, хотя эти работы и выполнены на дрозофиле, по сути здесь речь идет о возможности исправления генетических дефектов посредством вмешательства человека. Если учесть, что трансформация у дрозофилы с 1982 г. применялась тысячи раз, становится очевидным, что по крайней мере на этом модельном объекте проблема исправления генетических дефектов уже в наше время эффективно решается достаточно рутинными методами.
2. Другая цель использования трансформации заключается в исследовании структуры самого гена, т. е. анализа его структурной и регуляторной частей (см. разд. 7.7). 3. Трансформацию на дрозофиле используют для экспериментальной экспрессии генов из других организмов, у которых еще не открыты мобильные элементы, пригодные для создания транспозонов, и не разработаны методы трансформации. Например, можно выделить какой-то ген из генома бабочки-шелкопряда, комара или человека, ввести в геном дрозофилы и проанализировать экспрессию.
Созданы еще более уникальные конструкции, связанные с пересадкой генов. Приведем один пример. Известно, что в геноме комара С)!!гнпотия ?лиьчтг ?Ьтпт! присутствуют фракции, повторенные множество раз. Единицей этого повтора является фрагмент длиной ! 20 пн„обогащенный А — Т-нуклеотидами. Это так называемый С?и-повтор. Он рассеян по всей длине хромосом СЬ. ?)ь ?!!ишт?, по почти полностью отсутствует у очень близкого вида С)ь Й. Р?лег, т.
е. этот повтор является варьируи>щей фракцией генома хирономнд. Считается, что повторенные последовательности оказывают инактивирующее влияние на гены, расположенные рядом. Для того чтобы проверить предположение об инактивирующем влиянии С?а-повтора, был создан транспозоп, содержащий кроме маркер- ного гена гезу еще последовательность нуклеотидов, состоящую из нескольких копий С!и- повтора из ДГ!К хирономуса и расположенно- ОБЩАЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА 7.5. СТРУКТУРА ТРАНСКРИПТА: СТРУКТУРНАЯ И РЕГУЛЯТОРНАЯ ЧАСТИ ГЕНА Ф.
Транскрипция Стартовая точка транскрипции Терминатор Промотир Участок ньиие Участок ниже с>арта транскрн~щнн с>арса транскрниинн Единица транскрипции, солержаи>ая различные элементы гена [Ееичп, 2000. Р. 234! го рядом гена нЫе (н), выделенного из генома дрозофилы. Этот транспозон был введен в эмбрионы дрозофилы, мутантные по гену >г. Нормальный аллель >г' обеспечивает формирование у мухи глаз красного цвета, в то время как у гомозигот по мутации н глаза белые.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
