В.М. Глазер, А.И. Ким, Н.Н. Орлова, И.Г. Удина, Ю.П. Алтухов - Задачи по современной генетике (1117657), страница 27
Текст из файла (страница 27)
Среды для обнаружения рекомбинантов готовят на основе минимальной среды с добавлением стрептомицина. В среду для выявления клонов рекомбинанта Ееи+ надо внести пролин и аденин, для рекомбиианта Рго' — лейцин и аденин, для Рпг' — лейцин и пролин. Среда для обнаружения !.ас' должна содержать лактозу в качестве единственного источника углерода и все вещества, в которых нуждается реципиентный штамм, т. е. лейцин, пролин и аденин.
Рекомбинанты можно отбирать двумя способами: 1) часто проводят отбор по самому проксимальному из изучаемых маркеров (если это уже известно), и затем у полученных рекомбинантов производят анализ остальных маркеров, которые будут выступать в качестве неселективных; 2) можно высевать пробы из конъюгационной смеси на селективные среды для отбора всех типов рекомбинантов одновременно. Оба способа дают сходные результаты. Предполагаемый график кинетики появления рекомбинантов для анализа по первому способу имеет следующий вид: Кинетика появления рекомбинантов в скрещивании НггН х Е-!епА ргоА !асХ ригЕ гра1.
100 г и е а,з о я й Ф ~рг а й го ас' пг' 50 Аг!е') 0 0 1О 20 ЗО 40 50 60 Продолжительность кояъюгапии (мин) 155 Точка пересечения кривой, изображающей кинетику появления рекомбииаита, с осью абсцисс указывает время переноса соответствующего гена данным штаммом Н1г. Именно эта величина используется для картироваиия гена. Из-за асиихроииости формироваиия коиъюгирующих пар частота рекомбииаита возрастает во времени, ио затем выходит иа плато.
Уровни этих плато для разных рекомбииаитов тем ниже, чем дальше отстоят соответствующие гены от точки начала переноса хромосомы (0) данным доиориым штаммом. Это объясняется спонтанными разрывами коиъюгирующих пар, происходящими помимо прерываний скрещиваиия, производимых экспериментатором. Чем более удален доиориый маркер от точки О, тем больше разрывов произойдет до того, как ои войдет в реципиеитную клетку.
Задана № 442 Решение Для анализа генотипов рекомбииаитов Ага' Яг' следует использовать две синтетические среды (обе содержат арабииозу или глюкозу в качестве источника углерода и стрептомиции): одна с добавлением лейцииа (без изолейцииа и валина), вторая с добавлением изолейцииа и валина (без лейцииа). В этом скрещивании доиориый маркер агаА' передавался реципиеитам последним, следовательно, маркеры 1еиА' и 11иН' обязательно вошли в реципиеитиые клетки.
Из-за малых расстояний между генами метод прерывания коиъюгации для определения последовательности их расположения непригоден. Необходимо картировать гены по частотам рекомбинации между ними. Здесь полезно представить два возможных порядка расположения генов схематически (верхияя линия соответствует фрагменту доиориой ДНК, стрелка указывает направление передачи хромосомы; нижняя линия изображает Участок хромосомы реципиента): 1еи' 11о' ага 11и' 1еи ага" ага 11и 1еи ага 1еи 11и Рекомбииация между линейным фрагментом доиориой ДНК и кольцевой хромосомой реципиента осуществляется путем парпых обменов.
Из приведенной в условии таблицы очевидно 156 резкое преобладание рекомбинантов 1-го типа — Ага' 1!ч" 1.ец', для появления которого необходимы два кроссинговера, произошедших где-то по обе стороны вне участка хромосомы, несущего эти гены. Известно также, что при конъюгации у Е. сой кроссинговер происходит наиболее эффективно на концах донорного фрагмента. ага' 1еи" 1Ь' ага" Й~' !еи' Рекомбинанты 4-го типа — Ага+ 1!ч (.еп также возникают в результате одной пары обменов, но один из них происходит в узком отрезке между изучаемыми генами, что снижает частоту этих рекомбинантов.
ага' 1еи' 1!и' ага' !!э' 1еи' Для образования рекомбинантов 2-го типа — Ага' 1!ч' 1.ец при порядке генов, представленном на левой схеме, необходимы четыре обмена, а по правой схеме — только два обмена. Четыре кроссинговера одновременно — событие более редкое, чем два. Тот факт, что в проведенном эксперименте рекомбинанты 2-го типа отсутствуют, свидетельствует в пользу левой схемы. ага' 1еи" 11ю' ага' Й~' !еи' Для возникновения рекомбинантов 3-го типа — Ага+ 11ч 1.ец+, наоборот, необходимы два обмена по левой схеме и четыре по правой.
ага' 1еи' !!А' ага" !!э' !еи' Частота этих рекомбинантов сравнима с таковой для 4-го типа, что подтверждает правильность левой схемы. Определим расстояния между генами в условных рекомбинациопных единицах (%). В результате кроссинговера между генами агаА и 11оН возникают рекомбинанты Ага'1!ч (5 + 7). Следовательно, расстояние между агаА и 11сН(5 ч 7) х 100/370 = 3,2 %. Аналогичным образом, расстояние между агаА и 1еиА 7 х 100/370 = 157 = 1,9 %, между г1оН и 1еиА 5 х 100/370 = 1,3 %. Эти расчеты также доказывают порядок генов, приведенный в левой схеме.
Вывод — карта исследуемого участка хромосомы Е, со16 ага А 1,9 1еи А 1,3 11оН Задана.дв447 Решение Наличие котраисформации подтверждает оговоренное в условии сцепление приведенных в таблице генов. Очевидно также, что протототрофиые рекомбииаиты между различными мутаитами по биосиитезу триптофаиа могут возникнуть только в результате кроссииговера между сайтами мутаций. Второй кроссииговер, необходимый для интеграции доиориого фрагмента в реципиеитиую хромосому, должен произойти где-то в другом месте, в зависимости от взаиморасположения маркеров донора и реципиента. Например, если предположить, что схема расположения маркеров для скрещивания 1 имеет следующий вид: тг(В донор участок 1 2 з кроссинговеров ир реиипиент то первый кроссииговер должен произойти в узком участке 2 между 1пИВ и тгр, а второй — где-то в широком участке 3 справа от ггр (его ширина ограничивается размером доиорпого фрагмента).
В такой системе доля прототрофиых рекомбииаитов определяется частотой кроссииговера между сайтами мутаций и служит мерой расстояния между ними. Сопоставив расстоянии между мутациями попарио, получим карту исследуемого участка хромосомы ВасгПив виБН11к Наибольшая частота кроссииговера (67,4 %) наблюдается между апг и Ьив оии являются крайними на карте. Далее следует располагать картируемые гены по отношению к Ьил который чаще представлен в скрещиваниях, чем апд Судя по даииым таблицы, ближайшим к гену Ьгв является геи ггр (19 и 26,6%, возьмем среднее значение 22,8 %).
Далее располагаются тг1В (41,4 %) и 1пг1А (44,9 %). Расстояние между 1пдА и тс(В можно 158 определить по разнице их расстояний от Ь1е: 44,9 — 41,4 - 3,5. В целом карта имеет следующий вид: апг 1пе1А 1пг1В Ггр 27,3 3,9 1,8 22,8 Обратите внимание на то, что при схеме постановки скрещиваний, использованной в этой задаче, неприемлем способ оценки сцепления генов по частотам их котрансформации (как в задаче № 422). Задача М450 Решение В этом эксперименте для отбора трансдуктантов 1.еп' использовали минимальную среду с добавлением треонина, для отбора трансдуктантов ТЬг' — минимальную среду с добавлением лейцина, трансдуктантов ТЬг' ) еп' — минимальную среду без добавок. На карте хромосомы Е.
со11, полученной методом прерывания конъюгации, гены гЬг-оперона занимают положение О, принятое за начало отсчета, а гены 1еи-оперона и локус устойчивости к ввиду натрия находятся на 2-й мин. Метод прерывания конъюгации недостаточно чувствителен, чтобы определить расстояние между локусами 1еи и аг1 и порядок их расположения на карте. Степень сцепления генов можно оценивать по частоте их котрансдукции. Тот результат, что среди трансдуктантов 1.еп" оказалось 48 % АгГ, а среди ТЬг' не было ни одного АгГ, свидетельствует, что локус аа расположен ближе к генам 1еи-оперона, чем к генам Йгоперона и дистальнее, т.
е. несколько более удален от Йг, чем 1еи. Только 3 % рекомбинантов ТЬг' унаследовали также маркер 1еи", следовательно, оба локуса удалены друг от друга настолько, что редко оказываются в одном трансдуцирующем фрагменте, вмещающемся в частицу фага Р1. Но так как такие события в принципе происходят, можно заключить, что размер трансдуцирующего фрагмента примерно совпадает с расстоянием между генами гЬги 1еи. Благодаря тому, что среди трансдуктантов ТЬг' не было ни одного с фенотипом АгГ, можно уточнить размер трансдуцирующего фрагмента: он соответствует расстоянию между между йг и отстоящим от него на 2 мин сайтом, расположенным между 1еи и ал. 2 мин карты Е. сей составляют 1/50 длины хромосомы, т.
е. -64 тыс. п. н. (исходя из размера хромосомы 3,2 млн п. н.). Размер трансдуцирующего фрагмента равен размеру генома несущего его бактериофага. № 452. Покажите, как отразится на последующей трансляции добавление цитидилового нуклеотида к началу данной кодирующей последовательности: 5'-АСА ССА САА САП ААС ПСС ССА ТЬг Агя Н|з Азр Азп Тгр Рго Используйте таблицу генетического кода (см. Приложение). № 453.
Покажите, как отразится на последующей трансляции добавление аденилового нуклеотида к началу данной кодирующей последовательности: 5'-АСС СБС САС АСП САС САС САС Мег Ъа! С!п ТЬг Пуз Азп Н|з Используйте таблицу генетического кода (см. Приложение). № 454". Три независимо полученных гистидинзависимых мутанта были обозначены как Ь|зА, Ь(зС и Ь1зП. Клеточные суспензии мутантов были высеяны штрихами на чашку с агаризованной глюкозо-солевой (минимальной) средой с добавлением ограниченного количества гистидина, достаточного для обеспечения слабого роста клеток Ь|з-мутантов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
