part4 (1116454), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Расстановку треков3. Расчет треков (устанавливается режим сглаживания – по 3точкам; порог чувствительности – положением рычажка справа;далее выбирают обрабатываемые пики и задают для них вершину,левую и правую границы после этого полученные данныезапоминают нажатием клавиши «принять»; ненужные пикиудаляют нажатием кнопки «удалить пик») Таким образомпроводят обработку всех треков на хроматограмме.4. Получение отчета: нажимают кнопку «отчет» и записываютрезультаты расчета треков.
Для вывода на экран полученныххроматограммнажимаюткнопку«хроматограмма»ираспечатывают их, нажимая кнопку «Print».Результаты расчетов заносят в табл. 36.Таблица 36. Значения Rf соединений и уравнения градуировочныхзависимостей для них№ВеществоЗначение RfУравнениеградуировочнойпрямойПо полученным площадям хроматографических пиков для стандартныхрастворов и контрольной смеси рассчитывают содержание никотиновой иγ-аминомасляной кислот в образце.164Работа 7.
Разделение аминокислот методом тонкослойнойхроматографииРазделение аминокислот является важной и распространеннойзадачей, решаемой методом тонкослойной хроматографии. Возможностьразделения аминокислот можно исследовать на примере разделенияаргинина, аланина, валина и триптофана, формулы которых приведены втабл.37. :Таблица 37.
Изучаемые аминокислотыАминокислотаФормулаАргинин(NH)(NH2)CNHCH2CH2(NH2)COOHАланинСH3CH(NH2)COOHВалин(CH3)2CHCH(NH2)COOHТриптофан(С8H7N)CH2CH(NH2)COOHРеагенты и аппаратураЭтанольные растворы аминокислот (0,12 мг/мл).Подвижная фаза изобутанол-изопропанол-вода-уксусная кислота(5:4:3:0.2).1% раствор нингидрина в этиловом спирте.Пластинки Сорбфил ПТСХ-АФ-В-УФ.Камера для ТСХ.Пульверизатор для опрыскивания хроматограмм.Микрошприц на 10 мкл.Установка для нанесения проб на пластинку ТСХ – УСП – 1м.Фен для сушки пластин для ТСХ.Видеоденситометр Сорбфил.Выполнение работы.Готовят разбавлением стандартных растворов4 серии этанольных растворов аминокислот с содержанием:0,025; 0,05;0,075; и 0,10 мг/мл.165На пластинке карандашом проводят линию старта на расстоянии 1,5см от края и закрепляют пластинку на столике ТСХ – УСП-1м, которыйподогрет до 500С.
С помощью микрошприца наносят пробы стандартныхэтанольных растворов аминокислот и контрольной смеси по 2 мкл.Пластинку с нанесенными пробами помещают в герметичнуюхроматографическую камеру, куда предварительно наливают 10 млподвижной фазы. Пластинку выдерживают в камере около часа, так чтобыфронт растворителя поднялся на 7–10 см. Затем пластинку вынимают изкамеры, высушивают феном.
Для обнаружения аминокислот пластинкуопрыскивают раствором нингидрина из пульверизатора и нагревают 10–15мин в сушильном шкафу при температуре 1000С до появления окрашенныхпятен. Проявленные пластинки помещают в камеру денситометра и спомощью видеокамеры и системы AverTV Studio вводят записьвидеоизображения пластины в память компьютера. Затем в программевидеоденситометра Sorbfilобрабатывают полученный видеоролик, какописано в работе 6.Порезультатамобсчетахроматограммзаполняюттаблицу,аналогичную табл.
36. По полученным площадям хроматографическихпиков аминокислот для стандартных растворов и контрольной смесирассчитывают содержание аминокислот в контрольной смеси.Работа 8. Хромато-масс-спектрометрическое определениеорганических соединений средней летучести(задача подготовлена к.х.н., с.н.с. Глазковым И.Н.)Метод хромато-масс-спектрометрии является одним из наиболеевысокоселективныхивысокочувствительныхметодованализамногокомпонентных смесей органических соединений разной природы.Одной из наиболее простых задач, которую приходится решать этимметодом,являетсяопределениемассовой166концентрациизаданныхорганических соединений средней летучести (Ткип.
в диапазоне 200 –4000С) в органических экстрактах. Такие экстракты получаются послесоответствующей пробоподготовки, в основном, при анализе объектовокружающей среды (вода и почва). К соединениям средней летучестиотносятся ряд нормируемых экотоксикантов: фенолы, полиароматическиеуглеводороды, фталаты, хлорбензолы и др.Блок-схема хромато-масс-спектрометра выглядит следующим образом:ИсточникионовХроматографМассанализаторСистемасбора иобработкиданныхДетекторионовПосле разделения на хроматографической колонке вещества попадают вкамеру ионизации масс-спектрометра. Наиболее старый и широкоприменяемыйметодионизации─ионизацияпучкомэлектронов.Столкновение молекул с электронами приводит к образованию ионов. Приэтом молекулы часто разваливаются на заряженные фрагменты поопределенному для каждого соединения механизму. Процесс ионизациидолжен происходить в вакууме 10-7-10-6 мм.рт.ст.После ионизации ионы попадают в масс-анализатор.
Наиболеешироко распространенный квадрупольный масс-анализатор представляетсобой четыре стержня, к которым попарно в противоположной полярностиподается определенная комбинация постоянного и радиочастотногопеременного напряжений. Ионы, влетающие параллельно оси этихстержней, попадают в гиперболическое поле и, в зависимости отсоотношения их массы (точнее, m/z) и частоты, пропускаются этим полемили не пропускаются дальше.Последнимэлементоммасс-спектрометраявляетсядетекторзаряженных частиц. Для этой цели используют динодные вторично-167электронные умножители, в которых ион, попадая на первый динод,выбивает из него пучок электронов, которые в свою очередь, попадая наследующий динод, выбивают из него еще большее число электронов и т.д.Другойвариантвозникающеепри─фотоумножители,бомбардировкерегистрирующиеионамилюминофора.свечение,Конечнымрезультатом всего этого процесса является масс-спектр, несущийинформацию о структуре молекулы.С помощью системы обработки данных проводят качественнуюидентификациюповременамудерживанияиотносительнойинтенсивности одного основного и двух подтверждающих ионов (m/z)масс-спектра.Количественноеопределениеидентифицированногосоединения выполняют методом «внутреннего стандарта», для которогопредварительно определяют градуировочный поправочный коэффициент(F), показывающий во сколько раз отклик масс-селективного детектора(площадь хроматографического пика, соответствующая основному дляданного конкретного соединения иону m/z) на единицу массы веществаотличается от отклика масс-селективного детектора на единицу масс«внутреннего стандарта».
Вещества, используемые в качестве внутреннихстандартов, приведены в табл.38.Реагенты и аппаратураХромато-масс-спектрометр фирмы «Финниган», модель Incos 50,состоящий из:– квадрупольного масс-спектрометрического детектора Incos 50;– газового хроматографа Varian 3400, оснащенного капиллярнойколонкой длиной 30 м, диаметром 0,32 мм; неподвижная фаза ─SE-54, толщина пленки неподвижной фазы ─ 1 мкм;– системы обработки данных Prolab Vector 2.Микрошприц емкостью 10 мкл.Раствор смеси 15 среднелетучих органических соединенийвметаноле, концентрация компонентов – 10 нг/мкл.Раствор смеси 44 среднелетучих органических соединений вметаноле, концентрация компонентов – 10 нг/мкл.168Раствор смеси внутренних стандартов (табл.38), концентрациякомпонентов – 40 нг/мл.Раствордекафтортрифенилфосфинавдихлорметане,концентрация 1 мкг/мкл.Газ-носитель – гелий очищенный марки А.Метанол, хроматографически чистый.Таблица 38.
Состав смеси внутренних стандартовСоединениеФормулаC6Cl2D4Молекулярная масса151Основнойион152Вторичныеионы150, 1151,4-Дихлобензол-d4Нафталин- d8C10D813613668Аценафтен- d10C12D10164164162, 160Фенантрен- d10C14D1018818894, 80Кризен- d12C18D12240240120, 236Перилен- d4C20D12164164260, 265Проверканастройкимассприбораподекафтортрифенилфосфину. Для проверки настройки шкалы массприбора ввести в инжектор хроматографа в режиме «без деления потока» 1мкл раствора декафтортрифенилфосфина в метаноле с концентрацией 100нг/мкл и провести хроматографическое определение в условиях:400С4 мин100С/мин2500С20 мин2700СНачальная температура термостатаВыдержкаСкорость нагреваКонечная температура термостатаВыдержкаТемпература испарителяВывести масс-спектр декафтортрифенилфосфина, и сравнить полученныезначения с допустимыми, представленными в табл.39.
Если полученныезначения удовлетворяют табличным, то можно проводить дальнейшиеизмерения.169Таблица 39. Допустимые значения интенсивностей ионов масс-спектрадекафтортрифенилфосфинаМасса иона516870127197198199275365441442443Относительная интенсивность30-60 % от массы 198<2% от массы 69<2% от массы 6940-60% от массы 198<1% от массы 198основной пик, 100%5-9% от массы 19810-30% от массы 198>1% от массы 198меньше,чем 443>40% от массы 19817-23 % от массы 442Контроль стабильности градуировочной характеристики.
Дляопределения стабильности градуировочной характеристики прибора дляобозначенного преподавателем соединения проанализировать полученныйу него градуировочный раствор. Ввести в инжектор хроматографа врежиме «без деления потока» 1 мкл градуировочного раствора и провестиопределение в условиях:400С4 мин100С/мин2700С20 мин2700С2600С50 – 500 а.е.м.не менее 1 скан/секНачальная температура термостатаВыдержкаСкорость нагреваКонечная температура термостатаВыдержкаТемпература испарителяТемпература интерфейса ГХ/МСДиапазон сканированияСкорость сканированияВсоответствиисданнымитабл.40,41,гдеприведенымассыхарактеристичных ионов для двух стандартных смесей среднелетучих170Таблица 40. Состав и массы характеристичных ионов 15 компонентнойсмеси среднелетучих соединенийC6H6OМолекулярная масса94Основной Вторичныеионионы65, 66942-ХлорфенолC6H5ClO12812864, 1302-НитрофенолC6H5NO3139139109, 652,4-ДиметилфенолC8H10O122122107, 121Бензойная кислотаC7H6O2122122105, 772,4-ДихлорфенолC6H4Cl2O163162164, 984-Хлор-3-метил-C7H7ClO142107144, 1422-МетилфенолC7H8O108107108, 77, 79, 904-МетилфенолC7H8O108107108, 77, 79, 902,4,6-Трихлорфенол C6H3Cl3O197196198, 2002,4-ДинитрофенолC6H4N2O518418463, 1544-НитрофенолC6H5NO3139139109, 654,6-Динитро-2-C7H6N2O519819851, 1052,4,5-Трихлорфенол C6H3Cl3O197196198, 97,132, 99Пентахлорфенол166266264, 268СоединениеФормулаФенолфенолметилфенолсоединений,найтиC6HCl5Oнахроматограммепики,соответствующиеопределяемому соединению (задается преподавателем) и внутреннемустандарту.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
