part3 (1116453)

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла

5. Капиллярный электрофорезМетод капиллярного электрофореза (КЭ) основан на разделениикомпонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действиемприложенногоэлектрическогополя.Микрообъеманализируемогораствора вводят в капилляр, предварительно заполненный подходящимбуфером – электролитом. После подачи к концам капилляра высокогонапряжения (до 30 кВ), компоненты смеси начинают двигаться покапилляру с разной скоростью, зависящей в первую очередь от заряда имассы (точнее – величины ионного радиуса) и, соответственно, в разноевремя достигают зоны детектирования. Полученная последовательностьпиковназываетсяэлектрофореграммой,приэтомкачественнойхарактеристикой вещества является параметр удерживаниямиграции),аколичественной–высотаилиплощадь(времяпика,пропорциональная концентрации вещества.

На рис. 37 показана схемаустановки для капиллярного электрофореза.Рис. 37. Схема установки для капиллярного электрофореза130На заряженную частицу в простейшем случае действуют двепротивоположно направленные силы – электростатического притяжения исопротивления движению частицы.

В равновесных условиях действие этихсилуравновешиваетдругдруга,искоростьмиграциичастицыопределяется выражением:µ = q .E/6πηr.(16)где q – заряд иона, а E – напряженность электрического поля. η- вязкостьсреды, r – радиус частицыЭлектрофоретическаяподвижностьµэфопределяетсякакскоростьдвижения частицы, деленная на напряженность электрического поля:µэф = vэф/Е.(17)где, vэф – скорость идеализированной сферической частицы.

ВПри проведении разделения в капиллярах особенно важное значениеприобретает электроосмотический поток (ЭОП), связанный с движениемдиффузной части двойного слоя, образующегося относительно заряженнойповерхности внутренней стенки капилляра (рис. 38).Рис. 38. Схема возникновения электроосмотического потокаКакправило,отрицательнозарядзаряженныхповерхностисиланольных131определяетсягруппнаналичиемповерхностинемодифицированных кварцевых капилляров или создается за счетдополнительной модификации поверхности.Результирующая подвижность частиц µ определяется суммойэлектрофоретической и электроосмотической подвижностей:µ = µ эф + µ эо.Этодаетопределенные(18)преимуществаприанализесмесейпротивоположено заряженных ионов, поскольку все определяемыекомпоненты будут двигаться в направлении детектора вследствие ЭОП.Однако скорость передвижения ионов с одинаковым направлениемэлектрофоретическойиувеличиваться,противоположеннымаэлектроосмотической–подвижностейбудетуменьшаться.Длянемодифицированного кварцевого капилляра в диффузной части двойногоэлектирического слоя присутствует некоторая избыточная концентрациякатионов, в результате движения которых возникает ЭОП, направленный ккатоду.Врезультатекатионыбудутперемещатьсябыстрееидетектироваться до ЭОП, а анионы медленнее и детектироваться послеЭОП, нейтральные молекулы движутся с ЭОП, как это показано на рис.

39.абРис. 39. Движение заряженных частиц в немодифицированном кварцевомкапилляре (а) и общий вид электофореграммы смеси частиц с различнымизарядами (б)132Для повышения воспроизводимости КЭ в присутствии ЭОП,электроосмотический поток должен быть постоянным в течение всехпроводимых определений, а сохранение постоянства ЭОП часто требуетзначительных усилий по подготовке до и после работы. В кварцевыхкапиллярах ЭОП уменьшается при увеличении концентрации электролитаи добавлении органических растворителей и возрастает с увеличением рН,а также зависит от вязкости раствора в капилляре и температуры. Если жепри добавлении катионных поверхностно-активных веществ (ПАВ) кразделительному буферу на поверхности капилляра адсорбируетсяположительный заряд (рис. 40), то ЭОП меняет направление и переноситразделительный буфер в направлении анода.Рис. 40.

Изменение направления электроосмотического потока примодификации кварцевого капилляра катионными поверхностно-активнымивеществамиУникальной особенностью ЭОП является плоский профиль потока вкапилляре. Такой профиль выгоден, поскольку уменьшается размываниезонразделяемыхвеществ.Следуетотметить,чтоэффективностьразделения в капиллярном электрофорезе прямо пропорциональна, а время133анализа – обратно пропорционально напряжению, приложенному кэлектродам.Разделение в КЭ может быть выполнено как с положительной, так иотрицательнойполярностьюэлектродов.ЗнаязначениярКадлякомпонентов пробы, можно выбрать буфер с подходящим значением рН иполярность электродов, чтобы образец двигался в сторону детектора.Скорость миграции зависит от напряженности электрического поля,которая обычно составляет 200-400 В/см.Варианты капиллярного электрофорезаСуществуетрядвариантовкапиллярногоэлектрофореза,отличающихся по принципам и механизму разделения.Капиллярныйзонныйэлектрофорез(КЗЭ)являетсянаиболеераспространенным вариантом КЭ и предполагает использование одногобуфера в качестве разделяющей среды.

Разделение компонентов пробыосновано на различиях в подвижности заряженных молекул или ионов.Метод находит широкое применение при определении пептидов, белков,аминокислот, лекарственных препаратов, неорганических ионов и многихдругих объектов.Капиллярный ионный анализ – это разновидность КЗЭ в которой дляопределения неорганических ионов, не поглощающих свет в УФ-областиспектра,используетсякосвенноефотометрическоедетектирование,достигаемое за счет введения в буфер для электрофореза коионов,поглощающих свет в УФ-области спектра. Вытеснение коионов в зонеопределяемого иона уменьшает фоновое поглощение буфера, чтовыражается в появлении отрицательного пика на электрофореграмме.

Так,при разделении катионов используют различные органические основания,например, бензиламин. При определении неорганических анионов в буферобычно добавляют катионное поверхностно-активное вещество, которое134модифицирует поверхность капилляра и изменяет направление ЭОП.Посколькунаправлениеэлектрофоретическогопотокаиэндоосмотического потока совпадают, то в этом случае возможныэкспрессные и высокоэффективные разделения.Капиллярная электрокинетическая хроматография основана наразделениинейтральныхчастицприихраспределениимеждудвижущимися в электрическом поле частицами и заполняющим капиллярэлектролитом.

Такое распределение может быть обусловлено действиеммолекулярныхсил,комплексообразованиемион-парными(лигандныйвзаимодействиямиобмен),биоспецифическимивзаимодействиями. Имеются следующие разновидности капиллярнойэлектрокинетическойхроматографии:мицеллярная,ионообменная,лигандообменная и др.В мицеллярной капиллярной электрокинетической хроматографии(МКЭКХ) в буферный раствор вводят ПАВ, например, додецилсульфатнатрия, что приводит к образованию мицелл, которые будут двигаться каноду, ЭОП – по направлению к катоду. Разделение основано на различнойстепени связывания компонентов смеси с мицеллами.

Этот метод широкоиспользуется для различных классов как нейтральных, так и заряженныхсоединений, например, фенолов, ароматических аминов и др.Капилляры для разделенияПодавляющеебольшинстворазделенийвКЭпроводятсиспользованием кварцевых капилляров имеющих внешнее полимерноепокрытие, обычно - полиимидное, улучшающее их механическуюпрочность, и значительно реже полимерные капилляры, например изтефлона. Внутренний диаметр капилляров колеблется в пределах от 25 до200 микрон, а длина капилляра в зависимости от поставленной задачи - отнескольких сантиметров до 1 метра. Поскольку внешнее полиимидное135покрытие непрозрачно в УФ-области, то участок покрытия удаляют исоздаютокноспециальнойдляУФ-детектирования.пластиковойкассете.КапиллярНадежноезакрепляетсявтермостатированиекапилляра является основным условием получения воспроизводимыхвремен миграции определяемого соединения и площади результирующегопика, что важно для количественного анализа.Выбор оптимальных размеров капилляра представляет собойкомпромиссноерешениемеждутребуемойчувствительностьюопределения и разрешающей способностью.

Используют капилляры свнутренним диаметром 25-50 мкм, что является компромиссным решениеммеждудостаточновысокойчувствительностьюиэффективностьюразделения.Модифицированныекапилляры.Первоначальнобольшинстворазделений в капиллярном электрофорезе проводили с использованиемнемодифицированных кварцевых капилляров. Однако, необратимостьадсорбции белков, пептидов, фрагментов ДНК, а также электростатическиевзаимодействия разделяемых соединений с внутренней поверхностьюкапилляров приводят к значительному снижению эффективности иразрешающей способности, невоспроизводимости разделений. Это требуетдополнительных усилий по регенерации капилляров или даже их замене.Главная цель модифицирования внутренней поверхности кварцевогокапилляра состоит в изменении величины и направления ЭОП дляулучшения эффективности разделения, а также снижения адсорбции.

Характеристики

Тип файла PDF

PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.

Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.

Список файлов книги