А.Т. Лебедев - Масс-спектрометрия в органической химии (1111819), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Образование и размер кристаллов в значительной мере зависят от природы матрицы и растворителя и в меньшей степени от природы образца, поскольку количество последнего значительно меньше. Помимо соотношения матрица/анализируемое вещество на качество спектра сильно влияет наличие примесей и добавок. При работе с биологическими соединениями часто используются буферные растворы, соли, поверхностно- активные вещества. Эти соединения оказываются в растворе анализируемого образца и могут повлиять на качество спектров.
Существенным преимуществом МЛДИ по сравнению с электрораспылением является толерантность метода по отношению к примесям и добавкам, хотя в некоторых случаях эти побочные соединения могут приводить к уменьшению интенсивности основного сигнала по разным причинам. Качество спектров, как правило, не ухудшается, а иногда чувствительность может возрасти за счет образования ионов [М+катион]+. Поэтому, если количество примесей не является чрезмерным, образцы можно анализировать без предварительной очистки. 116 Глава 5. Альтернатнвные методы ноннзацнн образца Рнс.
5.10. Взаимодействие лазерного импульса с образцом МЛДИ: а — до лазерного импульса, б — после лазерного импульса Проведение анализа. Ионизация. Короткий световой импульс лазера поглощается молекулами матрицы и разрушает ее кристаллическую структуру. Часть молекул отрывается от поверхности и образует высокотемпературный суперплотный газ (зона шлейфа), в котором помимо молекул, ионов и ассоциатов матрицы присутствуют молекулы анализируемого соединения (рис.
5.10). Поскольку энергия лазера поглощается матрицей, молекулы образца оказываются в зоне шлейфа, в газовой фазе, практически без приращения внутренней энергии, т. е. с сохранением исходной структуры. Механизмы ионизации образца в условиях МЛДИ пока недостаточно изучены 1183 — 185). В масс-спектрах наблюдаются в основном пики однозарядных молекулярных ионов, причем катионы и авионы могут регистрироваться при простой смене полярности выталкивающего электрода. Помимо них часто наблюдаются пики однозарядных мультимеров (типа М„Н+).
Спектры образца оказываются очень похожими даже при использовании столь разных лазеров, как УФ и ИК. Этот факт указывает на общность механизмов ионизации для обоих вариантов. Обычно разделяют процессы на первичные и вторичные. Первичная ионизация включает процессы возникновения заряда у молекулы образца в момент ее перехода из конденсированной в газовую фазу. Вторичная ионизация обусловлена взаимодействием молекул образца с ионами матрицы в газовой фазе. Поскольку доля образца по сравнению с долей матрицы очень мала, взаимодействия молекул и ионов образца друг с другом маловероятны и не имеют большой значимости. Среди предложенных механизмов первичной ионизации можно выделить взаимодействие молекулы образца А с кластером молекул возбужденной матрицы М„' и протонирование молекулы образца возбужденной молекулой матрицы: М„*+А- М„+А++е М*+А — + АН++ 1М вЂ” Н1 5.14.
Матричная лазерная десорбнионная ионизация 117 Одновременно с переходом молекулы образца в газовую фазу может осуществляться ее взаимодействие с катионом соли, присутствующей в пробе случайно или добавленной намеренно. В этом случае возникают ионы [А+ катион]+. Значительно больше процессов ионизации предложено для молекул самой матрицы. Помимо указанных для молекул образца можно упомянуть двух- и полифотонную ионизацию, термическую ионизацию и диспропорционироваиие.
В зоне шлейфа образуется газовая плазма и протекают процессы вторичной ионизации. Механизмы этих реакций аналогичны описанным в разд. 5.2 и включают протонирование и депротонирование, перезарядку и присоединение аниона или катиона. Образовавшиеся молекулярные катионы и аиионы образца разных типов (М+', МН+, (М вЂ” Н], (М+катион]+ и т. д.) обладают невысокой внутренней энергией, т. е. их фрагментация незначительна. Расширение образовавшейся газовой плазмы за область шлейфа приводит к последующим взаимодействиям молекул и ионов образца с молекулами и ионами плазмы. Возникают новые ионы, а внутренняя энергия ионов образца усредняется в результате многочисленных столкновений с молекулами матрицы.
Интересные предположения о механизме ионизации сделаны Карасом и др. (184]. Авторы приводят достаточно убедительные доводы в пользу того, что исходные ионы образца (например, пептиды, осажденные из раствора при рН = 2) являются многозарядными, а в источнике протекает их последовательная нейтрализация.
Для положительных ионов уменьшение заряда обусловлено захватом тепловых электронов, образующихся в процессе фотоионизацин молекул матрицы и присутствующих в достаточном количестве в области шлейфа. Для отрицательных ионов ключевую роль играют взаимодействия с протонированными молекулами матрицы. Результатом этих процессов является полная нейтрализация первичных ионов. Немногочисленные оставшиеся однозарядные ионы, однако, успевают покинуть реакционную зону и достичь детектора. Нейтральные молекулы и частицы плазмы откачиваются насосами, а образовавшиеся ионы вытягиваются и ускоряются высоким потенциалом (-25 кВ) по направлению к анализатору. Практически во всех коммерческих приборах используется времяпролетный анализатор, поскольку он характеризуется неограниченным диапазоном масс (разд. 6.7), а основной задачей МЛДИ является как раз получение информации о молекулярной массе высокомолекулярных соединений.
Кроме того, именно времяпролетные приборы лучше других работают с импульсными методами ионизации и обладают высочайшей чувствительностью, так как все образовавшиеся в результате ионизации ионы достигают детектора. После того как детектора достигнет наиболее тяжелый ион, производится новый лазерный импульс, и весь процесс нонизации и регистрации ионов повторяется. Спектры после каждого лазерного импульса могут суммироваться до получения качественной информации о молекулярной массе соединения. Обычно для приемлемого результата оказывается достаточно 30-50 лазерных импульсов. 118 Глава 5. Альтернативные методы ионизации образца Важным моментом является возможность направлять каждый последующий лазерный импульс в новую точку образца. В случае равномерного распределения анализируемого соединения в твердом растворе матрицы спектры будут идентичными.
Однако поскольку идеальной равномерности достичь практически невозможно, концентрация молекул образца в каждом месте может несколько отличаться, и перемещением луча можно найти оптимальный участок поверхности. Для калибровки шкалы масс используются самые разнообразные соединения с точно известной массой. Среди наиболее широко используемых можно назвать грамицидин С (нз/г 1141,5), бычий инсулин (тн/з 5733,5), сыворотку бычьего альбумина (т/г 66430).
Используют варианты как внешней, так и внутренней калибровки. В первом случае калибровочный стандарт помещают на отдельной мишени, во втором — вместе с анализируемым соединением. Последний вариант приводит к увеличению точности определения массы примерно на порядок. Очень часто используют калибровку по двум точкам, когда в качестве реперов выбираются пик протонированного (депротонированного) молекулярного иона стандарта и пик его димера или двухзарядного иона. Используется также смесь двух стандартов. Важно, чтобы пик стандарта с известной массой располагался достаточно близко к пику молекулярного иона исследуемого соединения, но не накладывался на него.
Хотя разрешающая способность времяпролетных анализаторов, как правило, не превышает 10-12 тысяч, точность измерения масс достаточно высока и достигает 0,01%. Метод МЛДИ используется прежде всего для установления молекулярной массы соединения. Поскольку полностью избежать фрагментации не удается, в спектре часто наблюдаются малоинтенсивные пики фрагментных ионов, не имеющие значимости для структурных исследований. Если же возникает вопрос об установлении структурных фрагментов соединения, необходимо использовать определенные модификации обычного варианта анализа. Для этого используют спектры метастабильных ионов (роят зонгсе бесау), полученные с помощью рефлектрона 11861, или спектры активации соударением с использованием техники ортогонального ускорения (разд.
6.7). Вид спектра тяжелых молекул (рис. 5.9) значительно отличается от классического вида спектра ЭУ. Когда речь идет о молекуле массой в несколько сотен тысяч дальтон, разрешающей способности любого масс-спектрометра оказывается недостаточно для разрешения всей изотопной картины в области молекулярного иона. Обычные правила работы со спектром ЭУ, описанные в гл. 4, неприемлемы для соединений с молекулярной массой более 2000 Да. Прежде всего это касается извлечения информации на основе интенсивностей изотопных пиков (разд. 4.2).
Например, наличие в молекуле 100 атомов углерода приведет к интенсивности пика М+ 1 за счет присутствия одного атома 'зС 110% от интенсивности пика М+', обусловленного только атомами ыС. Пики М+2 и М+3, обусловленные двумя и тремя атомами 'зС в молекуле будут иметь интенсивности 60 и 22% соответственно. Даже водород, который учитывается при расшифровке спектра ЭУ как А-элемент (разд.
4.2), поскольку природное 5.14. Матричная лазерная деоорбцноннал ионизация 119 Рнс. 5.11. Область молекулярного иона соединения СмьНзп)чзоОза84 1 — номинальная масса (3408); 2— мононзотопнал масса (3409,3546); 3 — наиболее распространенная масса (3411,3613); 4 †средн масса (3411,721) маа маа зизо мм зам мза зма мю содержание дейтерия составляет 0,015% от содержания протия, приведет к появлению значимого изотопного пика М+1, если число атомов водорода в молекуле более 100. Другие элементы, практически всегда присутствующие в составе биологических молекул (Х, О, Я), усложняют изотопную картину еще значительнее. В результате огромное число изотопных пиков проявляется в масс- спектре в виде широкого сигнала, ширина которого может составлять сотни и тысячи дальтон (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
