А.Т. Лебедев - Масс-спектрометрия в органической химии (1111819), страница 25
Текст из файла (страница 25)
5.9). Кроме того, для высокомолекулярных соединений кумулятивный эффект дефектов масс атомов (разд. 6.3) становится значительным и ведет к существенным отклонениям номинальной массы, рассчитанной на основе целочисленных атомных масс элементов, от регистрируемой массы. В связи с этим для спектров тяжелых соединений приходится вводить еще несколько определений молекулярной массы (рис. 5.11). Номинальная масса †мас, рассчитанная суммированием целочисленных атомных масс наиболее распространенных (легких) изотопов элементов. Моноизотопиаи масса — масса, рассчитанная суммированием точных атомных масс (с учетом дефекта массы) наиболее распространенных (легких) изотопов элементов.
Наиболее распространенная масса — масса иона, пик которого наиболее интен- сивен в кластере молекулярного иона. Средняя масса — масса, рассчитанная суммированием усредненных атомных масс элементов. На рисунке 5.11 отчетливо видно различие между этими вариантами величин молекулярной массы соединения. Пик молекулярного иона с номинальной массой 3408 Да в спектре отсутствует„поскольку суммарный дефект массы оказывается больше 1 Дальтона. Минимальную массу в спектре имеет пик с моноизотопной массой. Ее величина 3409,3546 Да. Интенсивность этого пика уступает интенсивности последующих трех пиков в связи с высокой вероятностью присутствия в молекуле 1 — 3 более тяжелых изотопов.
В частности, следующий за пиком с моноизотопной массой пик состоит из пяти индивидуальных неразрешенных пиков, обусловленных присутствием изотопов зН, 'зС, ~~Х, '~0, ~~Я. Рассчитаем массы и относительные интенсив- 120 Глава 5, Альтернативные методы ионизанни образца ности этих пиков. Присутствие одного атома дейтерия в молекуле приведет к появлению пика иона с массой 3410,3580 Да и относительной интенсивностью (в сумме интенсивностей этих пяти пиков) 1,7;4.
Присутствие одного атома 'зС в молекуле приведет к появлению пика с массой 3410,3609 Да и относительной интенсивностью 89,2;4. Присутствие одного атома ~~Ы в молекуле приведет к появлению пика с массой 3410,3517 Да и относительной интенсивностью 6,2;4. Присутствие одного атома 'тО в молекуле приведет к появлению пика с массой 3410,3588 Да и относительной интенсивностью 1,2е4. Наконец присутствие одного атома зэка в молекуле приведет к появлению пика с массой 3410,3540 Да и относительной интенсивностью 1,7еА.
Чтобы увидеть эти пять пиков раздельно, нужен прибор с разрешающей способностью (разд. 6.3) более 4 000000. Следующий пик на рис. 5.11 с целочисленной массой 3411 (наиболее распространенная масса) состоит из 19 индивидуальных пиков, обусловленных одновременным присутствием в молекуле двух изотопов А+1 или одного изотопа А+2 ('аО или заБ). Поскольку основной вклад, как и в предыдущем случае, вносит изотоп 'зС, центр масс этого составного пика будет находиться около 3411,3613 Да.
Кстати, средняя молекулярная масса, рассчитанная из усредненных величин атомной массы элементов (разд. 5.12),находится рядом с этим пиком и составляет 3411,7210 Да. Видно, что пик с такой массой в спектре отсутствует, однако при получении спектров еще более тяжелых соединений, с массами в десятки тысяч дальтон, разрешающей способности любого прибора оказывается недостаточно для получения разрешенного кластера молекулярного иона. Пики ионов представляют собой огибающую шириной в сотни и тысячи дальтон, причем вершина этой кривой соответствует средней молекулярной массе соединения (рис. 5.9).
Вариантом МЛДИ является метод поверхностной матричной лазерной десорбциониой ионизации (ЯпгГасе ЕпЬапсей Еааег Реаогр11оп 1оп)ха11оп, ЯЕ).Р1), впервые описанный Хатченсом [187, 188). Метод позволяет резко повысить селективность анализа пептидов и белков благодаря модификации матрицы. К обычному материалу матрицы для МЛДИ добавляется соединение, которое может образовать химические связи с конкретным участком сложной молекулы.
Если на этот подготовленный микрочип нанести раствор смеси биомолекул, то только те из них, которые имеют в своей структуре подходящие места связывания, образуют химические связи с молекулами модифицированной матрицы. Последующая промывка микрочипа удаляет все несвязанные молекулы. После высушивания образец подвергается МЛДИ анализу [189, 190). Метод ЯЕ1Л31 показал превосходные результаты в решении биохимических и медицинских проблем: установление структур белков, идентификация биомаркеров, установление мест связывания антигенов, клинические исследования по выявлению заболеваний (туберкулез, диабет, рак, панкреатит, болезнь Альцгеймера и т.
д.), и многие другие [191-193). 5.15. Пирояитическая масс-сиеятрометрия 121 5.15. Пиролитическая масс-спектрометрия (Руго1уяй/Ма88 Ярестгоп1еФгу, Ру/МЯ) В классической масс-спектрометрии большое внимание уделяется сохранению исходной структуры анализируемого соединения. Поэтому спектры термолабильных образцов снимают при минимально возможной температуре или с помощью другого метода ионизации. Например, вместо ГХ-МС используют ЖХ-МС. Основной задачей пиролитической масс-спектрометрии является быстрое и эффективное термическое разложение веществ на более простые, которые подвергаются последую1цему анализу. Сейчас, когда методы электрораспыления или МЛДИ позволяют получать масс-спектры соединений с молекулярной массой в сотни тысяч и миллионы дальтон, метод пиролитической масс-спектрометрии используется в основном для анализа неразделимых смесей соединений: горючие сланцы, синтетические полимеры, гуминовые кислоты, микроорганизмы, другие биологические и геологические материалы.
Основам метода и его применению для анализа высокомолекулярных соединений посвя1цена книга Хмельницкого, Лукашенко, Бродского 11941. Пиролиз можно осуществить в самостоятельном приборе, а пиролизат затем перенести (например, в ловушке, охлаждаемой жидким азотом) в масс-спектрометр. Можно проводить пиролиз перед колонкой хроматографа или даже непосредственно в ионном источнике масс-спектрометра. В последнем случае получается только интегральный спектр, являющийся суперпозицией спектров всех соединений, образовавшихся в результате температурного разложения образца. Во избежание появления продуктов окисления, маскирующих реальную картину, пиролиз принято вести в среде инертного газа или в вакууме.
В качестве метода ионизации наиболее часто используют ЭУ, ХИ, полевую ионизацию, ионизацию лазером. Пиролитическая масс-спектрометрия, как правило, направлена на решение одной из двух задач: 1) Установление структурных фрагментов очень сложных соединений. 2) Сравнение образцов друг с другом (доказательство идентичности). В первом случае желательно использовать комплексный метод, типа ГХ-МС или ЖХ-МС, а во втором — предпочтительнее получать интегральный спектр. Такой подход отлично зарекомендовал себя, в частности, для сравнения микроорганизмов 1разд. 8.17). В этом случае структуры отдельных продуктов распада неважны, тогда как интегральный спектр можно рассматривать как «отпечатки пальцев» данного вида бактерий, вирусов, грибов и т. д. Идентичность двух образцов микроорганизмов друг другу устанавливают таким образом очень быстро и эффективно.
Важно лишь во избежание ошибок строго контролировать условия проведения эксперимента. Они должны быть абсолютно идентичны по скорости нагрева, типу разогрева образца и температуре пиролиза. Для целей де- 122 Глава 5. Альтернативные методы ионизации образца тального сравнения интегральных масс-спектров предложен ряд математических подходов 1195, 1961. Использование масс-спектрометра как термогравиметрического детектора позволяет надежно доказать, какое именно соединение выделяется образцом в каждом из зарегистрированных по уменьшению массы процессов. Температуру в этом случае медленно поднимают до нескольких сотен градусов. Несколько большими скоростями нагрева характеризуется метод катодного разогрева (с помощью сопротивления).
Для проведения такого анализа образец наносится непосредственно на проволоку из благородного металла. Проволока с образцом электрически программируемо нагревается до нужной температуры с нужной скоростью. Иногда для увеличения объема пробы ее помещают не непосредственно на проволоку, а в нагреваемую от нее кварцевую трубку. Такой подход хорошо зарекомендовал себя для анализа полимерных материалов.
Для получения спектров типа «отпечатков пальцев» наилучшие результаты получены при использовании индуктивного нагрева в точке Кюри (Снг(е-ро(п1 шбпсбне Ьеа11пб). Как уже отмечалось выше, для такого анализа первостепенное значение имеет воспроизводимость условий эксперимента. Точкой Кюри называется температура, при которой ферромагнетики теряют свои магнитные свойства. Например, для железа это происходит при температуре 770'С, для никеля 358'С, для кобальта 1120'С. Когда проволока (фольга), изготовленная из ферромагнитного материала, помещается в радиочастотное электромагнитное поле, происходит ее быстрый разогрев со скоростью до 104 К/с.
Точка Кюри достигается за доли секунды. В этот момент материал теряет свои магнитные свойства, и нагрев прекращается. Однако как только температура упадет на долю граауса, нагрев возобновляется. Если на проволоку (фольгу) нанести образец анализируемого материала, его пиролиз будет проходить при точно известной температуре.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
