А.Т. Лебедев - Масс-спектрометрия в органической химии (1111819), страница 23
Текст из файла (страница 23)
Поскольку ионы, образующиеся в условиях элекгроспрея, обладают значительно меньшей внутренней энергией, чем, например, в случае бомбардировки быстрыми атомами, их фрагментация практически отсутствует, а масс-спектр зачастую представляет собой набор пиков, обусловленных молекулярными ионами с различными зарядами (точнее [М+лН)" ь). Для инициирования фрагментации этих 110 Гааза 5. Альтернативные методы ионизации образца ионов необходимо использовать метод тандемной масс-спектрометрии (гл. 7). Типичный спектр полипептида представлен на рис. 5.7. Измерив массу этих многозарядных ионов, легко вычислить молекулярную массу соединения. В современных приборах это делает компьютер, но не представляет труда провести подобные вычисления вручную.
В отличие от традиционной масс-спектрометрии (гл. 4) в этом методе для работы со спектрами используют усредненные массы элементов: С 12,011, Н 1,00794, Х 14,00674, О 15,994, Б 32,066. Это объясняется тем, что высокомолекулярные соединения имеют очень сложную изотопную картину в области молекулярного иона, особенно многозарядного молекулярного иона. Разрешающей способности метода оказывается недостаточно, и пики получаются широкими, с неразрешенной изотопной картиной. Максимум такого пика определяется именно усредненной массой элементов.
Пусть М вЂ” масса молекулы, Н вЂ” масса протона, т~ и лзз — массы двух соседних пиков в масс-спектре с зарядами л+ 1 и л соответственно. Поскольку масс-спектрометр измеряет отношение массы к заряду, индивидуальные пики в масс-спектре (рис. 5.7) регистрируются на шкале масс со значением, которое определяется по уравнению: (5.3) Следовательно, масса молекулы может быть вычислена по уравнению: М = л(зл — Н) (5.4) Неизвестную величину л можно легко определить на основе регистрируемых масс двух соседних пиков, обусловленных ионами, отличающимися на один заряд.
В этом случае можно исходить из двух уравнений типа 5.3: М+ лН М+(л+ 1)Н лз2— и тз= л л+1 Решая эту систему уравнений относительно л, получаем (5.5) лзз — лз ! Результат необходимо округлить до ближайшего целого числа. Таким образом, можно рассчитать молекулярную массу по каждой паре соседних пиков и усреднить полученное значение. Электроспрей может эффективно использоваться для анализа соединений с массой до 150000 Да.
В случае более тяжелых молекул спектры становятся слишком сложными для расшифровки, так как очень большое число пиков многозарядных ионов располагается в сравнительно небольшом диапазоне (от лз/з 500 до лз/з 3000). Задача 5.1. Рассчитайте молекулярную массу полипептида, спектр которого представлен на рис. 5.7. 112 Глава 5. Альтернативные методы иоиизации образца 5.13. Ультразвуковое распыление (Яоп1с Яргау) Небольшое число работ выполнено с использованием ультразвукового распыления 155, 5б].
Этот метод позволяет получить спектры нелетучих термолабильных полярных молекул при стыковке масс-спектрометра с жидкостным хроматографом или системой для капиллярного электрофореза. В этом случае капилляр, соединяющий хроматографическую систему с источником масс-спектрометра, не обогревается и на него не подается высокий электрический потенциал. Ключевую роль играет поток азота, который подается в систему с очень высокой скоростью коаксиально капилляру с пробой 1рис. 5.8). Начиная с определенной скорости потока, прибор регистрирует ионы.
Именно скорость потока имеет первостепенную важность. Механизм ионизации (точнее десольватирования имеющихся в растворе ионов) пока не изучен. Сепараторы й] Ч~1 Рис. 5.8. Принципиальная схема метода ультразвукового распыления Метод хорошо зарекомендовал себя для анализа лекарственных препаратов и их метаболитов. Его чувствительность иногда на 2 порядка превосходит чувствительность традиционно используемой для этих целей химической ионизации при атмосферном давлении [57].
5.14. Матричная лазерная десорбционная ионизация, МЛДИ (Ма1г1х-А88Ыей Еайег Рейогр11оп/1опиа11оп, МАТЛН) Настоящий прорыв к анализу сложнейших биоорганических молекул произошел с появлением матричной лазерной десорбционной ионизации. Впервые метод описан во второй половине 80-х годов ХХ века 1177 — 179]. В 1988 г. были опубликованы результаты анализа белков с массами до 70000 Да 1180], а в 1990 г. — уже до 116 000 Да 1181].
Рекордные для масс-спектрометрии массы однозарядных ионов в несколько миллионов дальтон 1182] были зарегистрированы именно с помощью матричной лазерной десорбционной ионизации. Одному из первооткрывателей метода Кончи Танаке в 2002 г. присуждена Нобелевская премия в области химии. 5.14. Матричная лазерная леоорбционная ионизация 113 Метод заключается в облучении короткими лазерными импульсами образца, представляющего собой твердый раствор анализируемого соединения в органической матрице. Матрица выбирается таким образом, чтобы ее молекулы активно поглощали фотоны, эмиттируемые УФ- или ИК-лазером.
Над поверхностью образца создается плотная высокотемпературная плазма, в которой наряду с молекулами и ионами матрицы оказываются и молекулы анализируемого соединения. Ионизация последних путем поглощения энергии фотонов или в результате ионно-молекулярных реакций приводит к образованию положительных и отрицательных ионов, которые вытягиваются высоким потенциалом из области ионизации и направляются в анализатор. Метод характеризуется интенсивными пиками молекулярных ионов разного типа и низкой фрагментацией. Наиболее термолабильные, труднолетучие, высокомолекулярные соединения стали доступны масс-спекгрометрическому анализу.
К настоящему времени методом МЛДИ успешно анализируются полипептиды, белки, нуклеотиды, полисахариды, синтетические полимеры, гуминовые кислоты, фуллерены, органические комплексные соединения ит. д. (рис. 5.9). Количество переменных в МЛДИ значительно больше, чем в других методах, поэтому анализ нового соединения является самостоятельной задачей, причем выбор условий эксперимента может привести как к успеху, так и полному провалу.
Важнейшими параметрами метода являются природа матрицы, количественное соотношение матрица: анализируемое соединение, длина волны, долгота импульса и мощность лазерного излучения, способ пробоподготовки и т. д. Матрица. Как и в методе бомбардировки быстрыми атомами, в МЛДИ важнейшую роль играет матрица, однако ее роль в этом случае значительно отличается.
Правильный выбор материала является ключевым моментом для успешной регистрации масс-спектра. Количество самых разнообразных органических соединений, использованных в качестве матрицы, очень велико. Основные требования к материалу матрицы заключаются в его высокой способности поглощать лазерное излучение; кристаллизоваться с включением в структуру молекул анализируемого вещества; инертности по отношению к анализируемому веществу; хорошей растворимости в растворителях, используемых для пробоподготовки; низкой летучести в условиях вакуума.
Наиболее широкое применение в качестве матриц нашли коричная кислота, 3-амино-4-гидроксибензойная кислота, никотиновая кислота, и-циано4-гидроксикоричная кислота, 2,5-дигндроксибензойная кислота, 6,7-дигидроксикумарин, 2-(4-гндроксифенилазо)бензойная кислота, 3-гидроксипиколиновая кислота, 2,4,б-тригидроксиацетофенон и многие другие.
Обычно раствор матрицы в подходящем растворителе (концентрация 10 мг/мл) готовится ежедневно, поскольку он светочувствителен и подвержен фоторазложению. В качестве растворителей наиболее часто используются вода, этанол, ацетон, ацетонитрил, тетрагидрофуран, хлороформ и т. д. Источники МЛДИ с повышенным давлением позволяют использовать в качестве матрицы воду и ряд 5л4. матричная лазерная лееорбционная ионизация 115 других соединений. В этих условиях эффективность работы ИК-лазеров выше, чем УФ-лазеров 11821. Лазеры.
В идеале лазер должен эффективно передавать образцу контролируемое количество энергии, причем во избежание термического распада эта энергия должна переноситься в кратчайший период времени. Два наиболее активно используемых типа лазера в коммерческих приборах — азотный и углекислотный. Первый является ультрафиолетовым и характеризуется длиной волны 337 нм, энергией фотонов 3,68 эВ. Долгота его импульса составляет обычно от 0,1 до нескольких наносекунд.
Второй является инфракрасным и характеризуется длиной волны 10„б мкм, энергией фотонов 0,12 эВ. Долгота его импульса составляет от 100 нс до 1 мкс. Помимо этих лазеров используются неодимовые, эрбиевые, а также эксимерные (ХеС1, Агр, Ктр). Пробоподготовка. Раствор анализируемого вещества в растворителе, который хорошо смешивается с растворителем матрицы, в концентрации 5-10 мг/мл добавляется к рабочему раствору матрицы.
Молярное соотношение матрица/анализируемое вещество должно составлять от 100: 1 до 50000: 1 и оптимизироваться для каждого нового образца. После получения гомогенного раствора 0,5-2 мкл наносится на специальную плашку из нержавеющей стали и высушивается сначала при атмосферном давлении на воздухе, а затем при нагревании струей теплого воздуха в слабом вакууме. Природа взаимодействия матрицы с образцом пока недостаточно изучена. Во время высушивания происходит кристаллизация матрицы с включением молекул анализируемого вещества в кристаллическую решетку или же молекулы образца размещаются по поверхности быстро образующихся кристаллов матрицы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
