Н.С. Зефиров - Химическая энциклопедия, том 5 (1110092), страница 51
Текст из файла (страница 51)
При этом все чаще применюот иммобилизованиые клетки микроорганизмов, содержащие естественный набор ферментов. Преимушество тжой иммобилизации состоит в том, что исключаются стадии вьщеления, очистки и иммобилизации ферментов, увеличивается их стабильносп,. Иммобилизацию используют ие только для ферментов, но и для субстратов, коферментов и эффекторов. Предложены разнообразные реакторы с иммобилизованными ферментами — колонки, трубки, полые нити, Дла заполнения колонок применяют обычно ферменты, ковалентно связанные с аминированным стеклом, акриловыми полимерами, агарозой, сефарозой, иайлоновым порошком, силикагелем и т.д.
Один из лучших носителей для колоночиых режторов — сафарова, активироваиная бромцианом. На ней успешно иммобилизовали и полиферментные системы. Так, для определения 2 — 20 мкМ триптофана анализируемую смесь пропускали через колонку, содержашузо со- 149 ФЕРМ ЕНТАТИВНЫЕ 79 иммобилизовапиые на бромциан-сефаразе триптофаиазу и лжтатдепгдроге пазу. В трубчатых реакторах фермент ковалентно иммобилизуегся на внугр, пов-сти найлоновой трубки, длина к-рой варьирует от 1 до 3 м. С помощью таких реакторов, прокачивая через иих анализируемый р-р, определяют, напр., в сыворотке крови мочевину, мочевую к-ту, аминокислоты, глюкозу, лактозу, мэльтозу, пенициллин. Разработан метод включения ферментов внутрь полых волокон триацетатцеллюлозы в момент их формоваиия.
Фермент оказывается включенным во внутр. полость, худа могут проникать только иизкомол. субсграты. Эти нити нжручивают в виде катушек„заключают в стеклянную оболочку и через такой бобиниый фермснгный реактор пропускают анализируемую смесь, напр., при определении пенициллина, мочевины или глюкозы. Скорость пропускания потока смеси р-ров, савержюцих анализируемую пробу и реашнты, через реакторы устанавливают такои, что после прохождения через фермецтный режтор р-циа либо заканчивается (при анализе по конечному продукту), либо протекает до определенной глфбины (скорость обычно определяют способом фиксированного времени). Разневидиести Ф.
м. а. Среди наиб, чувствительных Ф.м.а. особое место занимают биолюминесцеитные методы (см. Люминесцетаиый анализ). Чаше других используют процессы, катализируемые ферментом люциферазой светляков. Система включает люциферин (ф-ла 1, люциферин светляка), к-рый в присуг. АТФ подвергается катапизируемому люциферазой окислению кислородом с образованием юомииесцирующего в-ва. Высокий квантовый выход биолюминесценции, применение полиферментных сопряженных рций позволяет определять нск-рые соед. при концентрации 0,001-0,1 пМ.
Один из важных Ф. м, а- анализ с использованием ф ерм сит иыхх электродов, к-рые сочетают высокую селективность биокатализа и совершенную технику электрохим. методов. В простейшем варианте растворимый фермент помещают между двумя полупроницаемыми мембранами; сина отделяет р-р фермеита от электродного датчика, др)тая — от анализируемого р-ра. Однако чаше ферменты иммобилизуют, жлючая их в полимерные или гглевые плеихи авьбумина, желатины, агар-агара, коллшена, гидроксида А! или ковалеитно присоедиияя к пов-сти стеклянных дисков, полупроиицаемых мембран (целлн:летных, поликарбонатных). Пленки прикрепляют к пов-сти электрода Часто тжую пленку (мембрану) готоват непосредственно на пов-сти электрода.
Субстрат диффундирует через слой, содержащий фермент, образуя электроактивное в-во, детектируемое при помощи пс тенциометрич. или амперомегрич. датчика Преимущества потеициометрич. детектирования — легкость изготовлеиив фермептного электрода и более низкая его стоимость. Однжо время отклика таких электродов весьма значительно. В качестве электрохим.
датчиков при создании ферментных электродов этого типа часто используют стеклянный рН-электрод, ХНчспецифичный элехтрод, газовые электроды для СОз и ХНз, Потенциометрич, ферментные электроды бьии предложенЫ для определении аминокислот, мочевины, глюкозы, пенициллина, нитрит- и нитрат-ионов; применяемые ферменты — оксидазы и декарбоксилазы аминокислот, уреаза, глюкозооксидаза, нитрит- и нитратредухтазы и др. Амперометрич. ферментиые электроды обычно применяют в случае ферментативиых р-ийй, протекающих с выделением или потреблением Оз или ЙзОз, Используют при этом Оз- или НзОз-чувствительные электроды.
Амперометрич. детекторы отличаются от потенциометрических более широким диапа- 150 80 ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ зоном линейности. В амперометрич. ферментных датчиках применяют чаще всего ФАД(флавинаденицпинухлеатнп)-зависимые оксидазы для определения глвжозы, холестерина, аминокислот. В ферментных электродах и.б. использованы не только одноферментные и палиферментные системы, но и клетки микроорганизмов (себжтериачьные» электроды).
Созданы ферменгные элехтроды с ферментным режтором. В тжом электроде иммобипизованный (напро на стеклянных шариках) фермент помещен в небольшой режтор, через х-рый пропускают анализируемую пробу. Продукты р-ции — зпехтроактивнме в-эа, их детектируют с помощью проточнмх измерительных электродов. Ферментные электроды тжого типа применяют для определения мочевины и аминокислот. Ферментные электроды препставнгнтт собой б и о с е н с оры (см.
Сенсоры линичесние), к-рые позволяют быстро и сслективно проводить определение целого рада компонентов в сложных по составу обьехтах. На основе использования ферментов созданы разя. э к си р е с с - т е с т ы. Многие из них чрезвычайно просты. Напр., тест-устройство для определения токсичных фосфорсодержащих пестицидов в продуктах питания представляет собой бумюкную полоску, один конец к-рой пропитан р-ром хромогенного субстрата, а второй аодержит иммобилизованную холинэстеразу. При анализе концы полоски совмещают и обмакивают в воду, выжатый из фруктов или овощей сок и т, д. Появление окрасхи бумажки свидетельсгвуег об отсутствии пестицидов в пробе. Т, к, пестициды в ббльших, чем ПДК„ кап-вах ингибируют хапинэстеразу, то отсутствие окраски свидетельствует о превышении ПДК пестицидов.
Аналогичные бумажные тесты предложены для определения глюкозы в моче и крови, ртути в воде и т.д. Широкое распространение пол)чают и и м у н о ф е рментные методы — разновидность иммунных методов анализа (радиоактивная или флуоресцентная матка заменяется ферментам). Их используют для определения имьгуноглг» булинав, гормонов, стероидов, лек. ср-в, пестицидов и др. Эти методы обладают исключительно высокой чувствительностью и селективноагью. Для повышения всюпроизводимости, жспрессности и производительности в Ф.
м. а. применнют авгоматич, анапизатс» ры разного типа (см, Автоматизированный анализ), Каталитич. р-ции с участием растворимых и иммобилизованных ферментов, а также ферментных реакторов все чаще используют в проточно-инжекционном анализе. Ф, м, а применяют в хим. анализе, по сравнению с др. методами, недостаточно. Из более чем 1800 полученных ферментов используют ок. 50, наиб, часто — глюкозаоксидазу, уреазу, уриказу, люциферазу, пероксидазу, алкогольдепедрогеназу, холинэсгеразу, лактатдегидрогеназу, разл.
аминооксидвзы. Ф. м. а. позволяю г определять селективно, а в отдельных случаях специфично такие биологически акгивнме субстраты, как глюкоза, мочевина и мочевая к-та, рвзл. аминокислоты, липидм, холесгерин, антибиотики, этанол, Н101, ХСЬ и ХОз и мн. дРУгие. РазРабатэны чРсзвычайно чувствительные методы определения мн, ферментов (пероксидэзы в крови, креатинфосфокиназы в крови при диапвхтике инсульта и инфаркта миокарда и др.) и коферментов (НАД, фпввинмононуклеатид, АТФ и т.д.). Предло;кены методики чувствительного определения большого числа эффекторов ферментов (фосфорсодержащие пестициды, ионы Н8, Сц, Еп и др.). Чрезвычайна чувствительны и селективны методы определения нек-рых ионов металлов (Кп, Сц) и анионов (СХ ) на основе реактивации апоферментов. Цинк, напр., определяют прюстически специфически и в пикограммовых кал-вах по реактивации иммабилизованной пируватоксидазы, дезжтивированной рядом комплексонов.
Осн. области применения Ф.м.а.— клинич, медицина и биохимия. С помощью ферментов в крови, моче, тки!як и др. биал, объектах определяют малые коп-ва физиологически жтивных в-в, метаболитов, ферментов, мугагенов, канцерогенов, лек. препаратов. Высокочувствительный и специфический биолюминесцентный метод определения АТФ позволяет 151 разрабатывать методики измерения кол-ва клеток микроорганизмов, обнаружения микробных заражений, определения антибиотиков в биол. тканях и зсидкоагях по степени ингибиронания микробных клеток.
Поскольку содержание АТФ пропорционально коп-ву клеток или биомассы, то эти метаджи чрезвычайно чувствительны и предел обнаружения 1'- ожет до«гигать 100 клегок. Ферментативные методы испо)тьзуют также в пищ, и фармжологич. иром-сти, при контроле загрязнений окружюощсй среды. Тж, напр., разработаны и применяются ферментативные методы определения фосфорсодержащих пестицидов, фенолов, аминов, ионов тнжелых металлов в природных и сточных водах. Лмвт Долм внове и.Ф., Угарово Н.Н., «ж. аналвг, хвмнн», 1980, т.
85, е. 8, с. 1597-1689; Кулис Ю, Ю., Аналвтвеесанс снстемы на основе вммобнлнзоваввых гэермснтоа, Ввлыык, 1981; Угарова Н.Н., Броал о Д. Ю., Бволымвнесцендвз н бновымннесцевтнай авалов, М., 1981; В!осла!убое! аррэсаболз ог свзувтез, ед. Ьу а. Звезет, е сб.г Меаобз ок Ыосьмтйса3 зла!уеее, Н. У., 199Х И Ф дол»сосен ФЕРМЕНТАТИВНЫИ КАТАЛИЗ (биокатализ), ускорение биохим. р-ций при участии белковых мжромолек)ы, называемых ферменнюми (энлимами). Ф. к.— разновидность катализа, хотя термин «ферментация» (брожение) известен с давних времен, когда еще не было понятия хим, катализа. Первое исследование Ф. к.
как хим. процесса было выполнемо К. Кирхгофом, к-рый в 1814 продемонстрироват ферментативную конверсию крахмала в растворимые углеводы. Заметный вклад в представление о природе Ф.к, внесли работы И. Берцелиуса и Э. Мичерлиха, к-рые включили фер. менгативные р-ции в категорию хим. катапитич. процессов. В кон. 19 в. Э. Фишеа высказан гипотезу о специфичности ферментативных р-ции и тесном стерич.
соотжтствии между субстратом и активным центром фермента. Основы кинетики ферментативных р-ций бьщи запоженм в работах Л. Михаэлиса (1913). В 20 в. происходит интенсивное изучение хим. основ Ф. к., получение ферментов в кристаллич. состоянии, изучение структуры белковых молекул и их активных центров, исследование багсьшого числа хонкретных ферментативных р-щ!й и ферментов. В простейшем случае ур-ние р-ции с участием фермента имеет вид: Е+8 ~» ЕЯ~ ~Е+Р, где  — фермент, 3 — субстрат, ВЯ вЂ” фермент-субстратный комплекс (т.
наз, комплекс Михаэлиса), Р— продукт р-ции. Превращение субстрата в продукт происходит в комплексе Михазлиса. Часто субстрат образует ковалентные связи с функц. группами активного центра, в т, ч, и с группами кофермента (см. Каферлеенгны). Большое значение в механизмах ферментативных р-ций имеет основной и кислотный катализ, реализуемый благодаря наличию имидазольных групп осгатхов пктипина и карбоксильных групп дикарбоновых аминокислот. Важнейшие особенности Ф. к.— эффективность, специфичность и чувствительность к регуляторным воздействиям.
Ферме!!ты увеличивают скорость хим. превращения субстрата по сравнению с неферментативной р-цией в 109-10' раз, Сталь высокая эффективность обусловлена особенностями строения активного центра. Принято считать, что активный центр комплеменгврен (ам. Каыплаиентарнасть) переходному состоянию субстрата при превращении его в продукт. Благодаря этому стабилизируется переходное состояние и понижается жтивац. барьер р-иии.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
