Г. Кристиан - Аналитическая химия, том 2 (1108738), страница 43
Текст из файла (страница 43)
С помощью данного метода можно получить распределение полимерных молекул по массе, а также разделить белки, ферменты, пептиды, нуклеиновые кислоты, гормоны и полисахариды. 21.2. ЗКСКЛЮЗИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ 226 Наибольшую массу молекул, способных проникать в гель и удерживаться на нем, называют пределом эксклюзии. Данная величина, в зависимости от конкретного геля, может принимать значения в диапазоне от 1000 до нескольких миллионов. Следует отметить, что разделения в большей степени осуществляются за счет различий в размерах и конфигурации молекул, нежели за счет разницы в молекулярных массах, но тут имеется определенная корреляция. Обычно молекулы, имеюи!иеразмерменьзиий, чем предел эксклюзии,могут быть фракционированы вплоть до определенного предельного размера (табл.
21.1). Перед использованием гели должны быть приведены в равновесное состояние (т. е. кондиционированы) путем контакта с растворителем, который будет применяться для дальнейшей работы. На это уходит несколько часов или суток в зависимости от состава подвижной фазы. В случаях, когда разрушаются поперечные сшивки полимерных веществ, требуется большее время вымачивания. Вер)забех — хорошо известный молекулярно-оптовый материал для разделения белков. Он представляет собой углеводный полимер, который ввиду наличия гидроксильных групп является достаточно полярным и поэтому адсорбирует воду. В процессе приготовления таких сорбентов степень сшивки можно контролировать, получая при этом материалы с различными диаметрами пор и пределами эксклюзии. Гели характеризуют по степени набухания, отражающей их «сродство к воде», и обычно выражают числом, присутствующим в названии.
Например, Берйас(ех 0-10 имеет сродство к воде 1 мл!г сухого геля, а берйадех О-200 — около 20 мл/г. Некоторые типы Берйадех гелей, а также диапазоны фракционирования разделяемых ими молекул приведены в табл. 21.1. Гели БерЬадех нерастворимы в воде и устойчивы к действию как слабых окислитель- но-восстановительных реагентов, так и оснований и слабых кислот.
Таблица 21.1 Характеристики гелей Зерйае!ех ' и В!о-Ое! а б-10 б-15 б-25 б-50 б-75 б-100 Сг-150 б-200 100-1 800 800-4 000 1 000-6 000 1 500 — 20 000 2 500-40 000 3 000 — 60 000 5 000-100 000 15 000 — 150 000 30 000 — 200 000 60 000-400 000 Р-2 Р-4 Р-6 Р-10 Р-30 Р-60 Р-100 Р-150 Р-200 Р-300 До 700 До 1 500 1 000 — 5 000 1 500-30 000 3 000 — 70 000 4 000-150 000 5 000-400 000 5 000 — 800 000 ' Данные любезно предоставлены РЬаппас!а Рше СЬеппса1, 1пс. С разрешения В!о-Каб 1.аЬошгопез.
' Верхний предел соответствует пределу эксклюзии. Диапазон фракционнрования' для Тип Берьабех пептидов и глобулярных белков Тип В!о-Ое! Диапазон фракциоиирования 22б ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ В(е-ое1, состоящий из полиакриламидов, является представителем более инертных молекулярно-ситовых гелей. Такие материалы нерастворимы в воде и большинстве органических растворителей и могут использоваться в диапазоне рН от 2 до 11.
Инертный гель снижает способность полярных веществ к адсорбции, степень которой можно варьировать с помощью Верпадех, изменяющего хроматографическое поведение этих веществ. Различные препараты В1обе1, и их разделяющие свойства также приведены в табл. 21.1. В1угайе! представляет собой гель на полистирольной основе, весьма полезный для разделений в неводных средах, таких как хлористый метилен, толуол, трихлорбензол, тетрагидрофуран, крезол, диметилсульфоксид и т.
д. Его нельзя использовать в воде, ацетоне или спиртовых средах. Данные гели могут быть полезны для получения сорбентов с пределами эксклюзии относительных молекулярных масс от 1600 до 40 миллионов. Молекулярные сита можно применять для обессоливания белков, полученных путем высаливания концентрированными растворами солей. Гели с низким пределом эксклюзии, например ВерЬадех 25, позволяют белковым молекулам свободно проходить сквозь колонку, удерживая при этом растворенные соли, а разбавление белка будет ограничено элюирующим объемом колонки (т. е. объемом, оставшимся после заполнения колонки набухшим гелем).
Для высокоэффективных хроматографических разделений используют мелкие частицы полистирола или микропористого силикагеля диаметром 5-10 мкм и размером пор от нескольких нанометров до нескольких сотен нанометров. Отобранные частицы силикагеля покрывают гидрофильной фазой с целью снижения адсорбции растворенного вещества. Полимерные частицы могут быть использованы в широком диапазоне рН (от 2 до 12), в то время как частицы силикагеля — только при рН 2-7. 21.3. Ионообменная хроматография В отличие от многих других типов хроматографии, используемых главным образом для разделения органических веществ, ионообменная хроматография особенно подходит для разделения неорганических ионов, причем как катионов, так и анионов,поскольку это разделение основано на ионном обмене в неподвижной фазе.
Данный метод оказался весьма полезным для разделения аминокислот. Неподвижная фаза в ионообменной хроматографии состоит из шариков сополимера стирола и дивинилбензола. Этот сшитый полимер (смола) имеет в своей цепи свободные фенильные группы, которые можно модифицировать с целью введения ионных функциональных групп. В табл.
21.2 приведены основные сведения о четырех типах ионообменных смол, используемых в аналитической химии. Подобно эксклюзионной хроматографии, в иоиообменной хроматографии применяются набивные колонки как для разделения под действием силы тяжести, так и в варианте ВЭЖХ. В последнем случае метод разделения называют ионной хроматографией (описание см. далее). 21.3.
ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ Таблица 21.2 Типы ионообменных смол Ткп ионообменияка Фуикцнояяяьияя иоиообмеииая группа Торговая марка Катионообменники Сильнокислотные 1уонех'50; АшЬег!1гея 1К120; 1опас ' СОС-240; Кехуп к 101; Репппг11' О Сульфогруппа АгпЬег! Ие 1КС 50; 1опас СОС-270; Кехуп 102; Репппб! Н-70 Слабокислотные Карбоксильиая группа Анионообменники Сильноосновные Четвертичное аммониевое основание Гуоп ех 1; АзпЬег1!!е 1КА 400; 1опас АОА-542; Кехуп 201; Репппб! 3-1 ТУо~чех 3; АзпЬея!1ге 1К 45; !опас АОА-316; Кехуп 203; Репппг1! % Слабоосповные Аминогруппа " Оом Сьепаса! Сатрапу. О Мя!!!пс!пас! Сьеписк! %егия. ' А Т. Вякяг СЬеписа! Сатрапу.
"Р!яьег Бс!епббс Согярапу. ' Мя!Ьеяоп Со!епип й ВеП. Катионообменные смолы пКхВО з Н+ -> М"+ (КхЗО ) М 4 пН+ (21.1) пКхСО ~ Н+ + М"и = (КхСОз)„М 4 пН' (21.2) где Кх — фаза катионообменника. Данные равновесия могут быть смещены влево или вправо путем увеличения или уменьшения [Н !или [М 1 по отношению к количеству присутствующего ионообменника. Катионообменные смолы обычно поставляются в Н"-форме, при этом протоны легко заменяются на катионы натрия после обработки ионообменников растворами соответствующих солей. В дальнейшем ионы натрия подвергаются замещению на другие катионы. Обменную емкость катионообменников выражают общим числом эквивалентов способного к замещению водорода в единице Смолы данного типа содержат кислотную функциональную группу, введенную в ароматическое кольцо полимера.
Сильнокислотными катионообменниками являются смолы, имеющие сульфогруппу — БОзН, которая подобно серной кислоте является сильной кислотой. Слабокислотные катионообменные смолы имеют карбоксильную группу — СООН, которая диссоциирует лишь частично. Протоны этих групп могут замешаться на другие катионы: 228 ГЛАВА 21 . ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ объема или массы смолы и определяют числом и силой ионных групп, закрепленных на ее поверхности. Обменная емкость напрямую связана с удерживанием ионов раствора, и катионообменники высокой емкости наиболее часто используют для разделения сложных смесей, где увеличение удерживания способствует лучшему разрешению.
Слабокислотные катионообменные смолы могут быть применены в более узком диапазоне рН от 5 до 14, в то время как сильнокислотные катионообменяики — в диапазоне рН от 1 до 14. Причина этого заключается в том, что при низких значениях рН катионообменные группы слабокислотных смол слишком сильно удерживают протоны для протекания обменной реакции. Помимо этого (в отличие от ионообменных групп сильнокислотных смол) они не способны полностью принимать катионы слабых оснований. Такое поведение, по сути, аналогично незавершенности реакции между слабой кислотой и слабым основанием.
Слабокислотные смолы обычно используют для разделения сильных оснований или же многофункциональных ионогенных веществ, таких как белки или пептиды, которые зачастую слишком сильно удерживаются на сильнокислотных катионообменниках, обычно применяющихся для разделения сложных смесей. Анионообменные смолы Основные группы на поверхности смол, в которых гидроксильные группы способны к обмену на другие анионы, являются составной частью анионообменных смол. Существуют как сильноосновные (четвертичные аммониевые основания), так и слабокислотные (аминогруппы) анионообменники. Происходящие в них реакции ионного обмена можно представить следующим образом: (21.3) лВе1 '(В.3 ОН .~- А"- — (Вх1 'Кз)„А -~- пОН лВяНН~зОН + А" = (Вх)4Нз),А+ лОН (21.4) где й — органический радикал, чаще всего метил.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
