Г. Кристиан - Аналитическая химия, том 2 (1108738), страница 41
Текст из файла (страница 41)
2. Выбор колонки. Существует около 100 различных торговых марок колонок с обращенной фазой. В паспорте колонки производители указывают число теоретических тарелок, селективность, воспроизводимость результатов по мере использования колонок, давление на входе в колонку и т. д. Эта информация помогает исследователю выбрать наиболее подходящую колонку в зависимости от решаемой задачи. Можно воспользоваться классификацией колонок для ОФ ВЭЖХ по какому-либо параметру и оценить качество работы колонки.
Один из способов— сравнение относительного удерживания определенного вещества, например, аспирина, на серии колонок с одинаковой полярностью. Другой подход — накопление массива результатов и статистическая обработка для сравнения серий колонок по эффективности, симметричности пика и размыванию заднего фронта пиков. Эти методы позволяют выявить относительно небольшие различия между марками колонок или сериями колонок одного производителя. Наконец, качество колонки часто оценивают эмпирически, воспроизводя эксперименты в условиях, рекомендованных производителем.
Это наилучший способ оценки и выбора подходящей колонки. На сайте ~чччч. шас-шод.сош/сошрапзоп Вшбе. Ыш1 приведено подробное сравнение 60 наиболее распространенных колонок с обращенной фазой Спе Колонки сгруппированы по относительной гидрофобности и полярности; указана их эффективность по отношению к нейтральным или основным соединениям.
Полную информацию можно также найти на сайте ЬПр Попс шкп йочаппсага1ой! сегбйса1еЫ 870. рбмк. 3. Градиентное элюирование. Приемы улучшения разделения, используемые в газовой хроматографии (увеличение скорости или задание температурного градиента) в методе ВЭЖХ имеют очень ограниченные возможности (за исключением скоростной хроматографии — см. ниже). Основной способ оптимизации, невозможный в случае газовой хроматографии — использовать градиент состава подвижной фазы.
Градиентное элюирование в жидкостной хроматографии — наиболее эффективный путь разделения аналитов с достаточно различающимися временами удерживания. При изократическом элюировании часто наблюдается недостаточное разрешение пиков слабоудерживаемых веществ, либо, в случае длительного удерживания компонентов, уширение пиков. В варианте ОФ ВЭЖХ градиент состава подвижной фазы создают постепенным увеличением содержания органического модификатора, например, метанола. При этом слабоудерживаемые вещества будут элюироваться позже и будут разделяться лучше, чем в случае изократического злюирования, а сильноудерживае- 216 ПМВА ги жИДКОСтНЯЯ ХЯОМЛтоП ЯфИЯ мые — наоборот, элюироваться за более короткое время.
Результатом является «компактная» хроматограмма (т. е. полученная за меньшее время), с хорошо разделенными острыми пиками и, возможно, с меньшими пределами обнаружения. поскольку размывание хроматографических зон будет меньше. Так же, как и температурный градиент в ГХ, градиентное элюирование может быть ступенчатым или непрерывным. Систему насосов программируют так, чтобы общая скорость потока оставалась постоянной. Исходный раствор должен иметь полярность, достаточную для элюирования и разделения первых, слабоудерживаемых, компонентов, а затем элюирующую силу подвижной фазы повышают до тех пор, пока не получают разрешение пиков сильноудерживаемых веществ за разумное время.
Метод выбора состава подвижной фазы, описанный выше, позволяет определить начальную и конечную полярность. Одна из проблем, возникающих при градиентном элюировании в обращен- но-фазовой хроматографии, — это необходимость регенерации, или переуравновешивания, колонки перед началом следующего эксперимента.
Обычно для регенерации требуется пропустить начальный раствор в объеме, равном не менее 15 — 20 объемов колонки. Дж. Дорен из Университета Флориды предложил методику регенерирования колонки за существенно более короткое время путем контроля в течение хроматографического процесса степени сольватации привитых алкильных групп 1ь. А. Со!е апд 3. б. Погзеу, Апа1. Слега., 62 (1990) 1б1.
Суть подхода состоит в том, что 354-й раствор изопропанола примерно на монослой покрывает алкильные цепи С м на поверхности сорбента, и тогда добавление 3', » изопропанола к кахСдому компоненту в подвижной фазе сокращает время регенерации на 75; ь Кроме того, вымачивание сорбента в изопропаноле может привести к повышению эффективности, особенно на начальном участке хроматографии, когда содержание воды в подвижной фазе высоко.
Более подробно теоретическое обоснование и практическое применение этого описано в статье [13. Е. %агпег апг) 1. б. Рогзеу, ьС-бС, 15(3) (1997) 254). Градиентное элюирование успешно используют в распределительной хроматографии на химически модифицированных сорбентах или в адсорбционной хроматографии. В жидкостно-жидкостной хроматографии этот способ элюирования практически не встречается.
Высокоскоростная хроматография: лучше меньше, да лучше Если взять короткую колонку и плотно заполнить ее очень малыми частицами, то на ней можно разделить смесь всего за несколько секунд, что примерно в 10 раз быстрее, чем в варианте ВЭЖХ на обычной колонке (где время разделения в большинстве случаев составляет около 20 мин). Колонки для высокоскоростной жидкостной хроматографии, как правило, имеют такой же диаметр, как и обычные колонки для ВЭЖХ (т. е. 4,б мм), но, в отличие от 25-сантиметровых ВЭЖХ-колонок, их длина составляет от 1 до 3 см. Чаще всего их заполняют частицами диаметром 3 мкм (в ВЭЖХ вЂ” 5 мкм), и пропускают элюент со скоростью 1 — 3 мл/мин. Высота, эквивалентная теоретической тарелке (Н), при высоких скоростях потока меняется очень плавно от линейной скорости (и) (см.
рис. 19.5), поскольку у таких малых частиц сопротивление массообмену мало (параметр С 21.1. ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ 217 в уравнении Ван Деемтера). Так как при заполнении малыми частицами существенно возрастает давление на входе в колонку, приходится использовать короткие колонки, в среднем содержащие около 4000 т. т., что вполне достаточно для большинства разделений.
За 30 с можно получить, по крайней мере, около 20 пиков веществ. Даже при том, что в условиях скоростной хроматографии полного разделения не достигается, такие эксперименты часто ставятся для решения множества аналитических задач, например, в фармацевтической промышленности, что уже составляет примерно половину задач, решаемых методами ВЭЖХ. При контроле качества лекарственных препаратов аналитикам часто требуется следить за определенными активными добавками в составе таблеток или за полным качественным составом препарата в целом.
Почему используют высокоскоростную жидкостную хроматографию? Помимо очевидных преимуществ экспрессного анализа в скоростной хроматографии экономится растворитель — его расходуется на 50-80'А меньше, и, соответственно, слив из колонки становится меньше.
В 3 — 5 раз возрастает чувствительность, потому что разбавление определяемого вещества в соответствующей хроматографической зоне в плотноупакованных коротких колонках с малым внутренним объемом заметно меньше. Но такие плотноупакованные колонки более склонны забиваться посторонними частицами.
Поэтому между инжектором и аналитической колонкой обязательно нужно устанавливать фильтр или, еще лучше, пред- колонку. Если нужно улучшить разрешение пиков при использовании короткой колонки, можно оптимизировать состав подвижной фазы так, чтобы значение фактора удерживания А находилось в диапазоне от 1 до 10 и чтобы элюирование аналитов шло медленнее. В этом случае разделение может проходить, скажем, за 10 мин вместо 30 с. Например, если в высокоскоростной жидкостной хроматографии применяют элюент с 50', о-м содержанием ацетонитрила, то для улучшения разрешения пиков нужен элюент только с 20',4 ацетонитрила.
Как и в скоростной газовой хроматографии, для рассматриваемого варианта жидкостной хроматографии требуются детекторы с практически мгновенным откликом, а также электронные интеграторы для измерения и обсчета узких (около 0,5 с или 3 мкл) быстро элюируемых пиков. Детекторы должны реагировать на все изменения в потоке эффлюента каждые 50 или 100 миллисекунд, а лучше еще чаще.
Интеграторы должны обрабатывать, по крайней мере, 10 точек в секунду, а в случае детектора с линейкой фотодиодов — не менее 5 сканирований в секунду. При таких быстрых измерениях существенное негативное влияние на результаты может оказать внеколоночное уширение пиков, поэтому необходимо минимизировать «мертвый» объем системы одним из возможных способов, например: уменьшением объема проточной ячейки детектора (менее 3 мкл); избеганием размывания пробы в инжекторе (промышленностью производятся инжекторы с очень малым обьемом внутренней петли); использованием коротких и узких капилляров в качестве соединительных частей хроматографа.
Но в ячейках столь малого объема путь для детектирования (например, длина оптического пути) становится короче, что может привести к снижению чувствительности, поэтому иногда встает задача поиска оптимальных условий. 21В глявягк жидкостняяхяомятогяяфия Колонки с узкими каналами: высокая чувствительность и малый расход элюентов Если же мы возьмем более узкую колонку, то снизим пределы определения за счет получающихся более узких и высоких пиков.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
