Г. Кристиан - Аналитическая химия, том 2 (1108738), страница 38
Текст из файла (страница 38)
Спустя несколько лет Шаба Хорват и его коллега С. Р. Липски из Йельского университета впервые осуществили хроматографическое разделение в варианте, названном ими жидкостной хроматографией под высоким давлением. Но это случилось уже в 1970-х гг., после того, как была разработана технология получения мелких частиц оксида кремния с силанированной поверхностью, что позволило использовать длинные колонки с малым внутренним обьемом, необходимые для более высокого разрешения. В настоящее время метод известен как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ, НРЬС). Теоретические основы Классическая жидкостная хроматография в значительной степени вытеснена намного более пригодной для аналитических целей формой ВЭЖХ, основные узлы которой изображены на рис. 21.1; на рис.
21.2 представлена фотография современного прибора для ВЭЖХ. Такие приборы обычно выпускают в виде отдельных блоков для сборки в отличие от большинства газовых хроматографов, что позволяет пользователю заменять или комбинировать различные составляющие части прибора. Скорость распределения растворенных веществ между неподвижной и подвижной фазами в классической жидкостной хроматографии главным образом зависит от скорости диффузии.
Диффузия в жидкостях происходит значительно медленнее, чем в газах. Чтобы минимизировать процессы диффузии и тем самым снизить время, необходимое для перемещения компонентов пробы к реакционным центрам внутри колонки и от них, необходимо выполнить два условия. Во-первых, колонка должна быть очень тщательно заполнена сферическими частицами одинакового размера — для достижения оптимальной плотности заполнения и их гомогенного распределения; во-вторых, неподвижная фаза должна представлять собой тонкий равномерный слой без застойных зон. Первое условие приводит к уменьшению параметра А в уравнении Ван Деемтера (т.
е. к уменьшению вихревой диффузии), второе — к уменьшению параметра С Гт. е. к более быстрому массопереносу между фазами, что необходимо при высокой скорости потока). Поскольку молекулярная диффузия в жидкостях незначитель- ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ Демпфер для сиикаиия пульсаций РИС. 21.1. Основные узлы хроматографа для ВЭЖХ (опубликовано с разрешения Апа1аЬз, 1пс. леееагсЬ 7Уоеее. СорупВ1н О!971) на, то и параметр В в уравнении (19.8) мал. Таким образом, существенного, как на рис. 19.4, возрастания высоты теоретической тарелки Н при низких скоростях потока не наблюдается. Значение Н в ВЭЖХ главным образом определяется скоростью массопереноса.
Зависимость Н от линейной скорости потока для жидкостной хроматографии выражается уравнениями Губера (19.21) и Нокса (19.23), приведенными в гл. 19, и графически представлена на рис. 21.3. Неподвижные Фазы Изначально в качестве сорбентов для ВЭЖХ использовали частицы неправильной формы на основе силикагеля или оксида алюминия размером 10 мкм или меньше. Впоследствии перешли к сферическим частицам, более равномерно заполняющим колонку и тем самым обеспечивающим более высокую эффективность метода (рис.
21.4). Это частицы на основе сверхчистого оксида кремния с низким содержанием следов металлов, с типичным диаметром от 5 до 10 мкм, хотя частицы с диаметром 3 мкм нашли более широкое применение для высокоскоростной хроматографии (см. ниже). Диаметр пор обычно составляет от 60 до 2! .1. ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ РИС.
21.2 Хромаззнраф для ВЭЖХ С разрешения Аа!!ев! Гестапо!оВ!еа ГЛАВА 2К ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ также использузот ддя решения широкого крут а задач. Жидкими неподвижными фазами либо покрывают частицы сорбезпа, либо закрепляки пх химическим спосооом. Наиболее часто приыенякгг мииропориегые частицы, пропицасмые для растворителя (рис. 2!.5, и). Высокая удельная площадь поверхности достигается 204 ГЛАВА 21.
ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ на поверхности частиц также экранированы пространственно расположенными СН, ! изопропильными группами — С вЂ” СН, вместо двух метильных групп в составе ! органохлорсиланового реагента, Большинство неполярных химически модифицированных неподвижных фаз для обращенно-фазовой хроматографии содержит группы Сга или Сз (показано выше), причем группу Сш (так называемый октадецилсилан — ОДС) используют намного чаще„группы Сз проявляют среднюю пщрофобность, а группы Сш— наиболее неполярные.
Также часто применяют фенильные группы [(СНз)зСьНз]. Сорбенты, модифицированные группами С, используют для ВЭЖХ в сочетании с масс-спектрометрией, поскольку для них характерны очень низкие потери неподвижной фазы. Полярные фазы для нормально-фазовой хроматографии представлены (в порядке увеличения полярности) цианогруппами [(СНз)за], диольными группами [(СНз)зОСНзСН(ОН)СНзОН], аминогруппами [(СНз)3)ЯНз] и диметиламиногруппами [(СНз)зЩСНз)з]. Когда частицы сорбента покрывают жидкой фазой, прежде чем закрепить ее химическим способом, силанольные группы на поверхности дезактивируют триметилхлорсиланом. Перфузионные наполнители с транспортными макропорами, предложенные Ф. Ренье и сотрудниками из Университета Пурду, содержат как большие сквозные норы, так и малые поры для диффузии (рис. 21.5, б).
Поры для диффузии, как и в микропористых частицах, обеспечивают сорбционную емкость. Сквозные транспортные поры позволяют подвижной фазе свободно проходить прямо через сорбент, тем самым увеличивая скорость массопереноса в подвижной фазе. Поскольку растворенное вещество в этом случае затрачивает меньше времени для полного массопереноса, то пики сужаются; процесс в целом представляет собой сочетание диффузии и конвекции.
Такие сорбенты имеют ббльшие размеры частиц, чем микропористые наполннтели — обычно около 12 мкм в диаметре. Их можно использовать при более высоких скоростях потока, при этом они наиболее эффективны при разделении макромолекул, например, белков. Также их часто применяют в препаративной хроматографии. Ненористые наполнители (рис. 21.5, с) как на основе оксида кремния, так и на основе полимерных смол характеризуются очень малым диаметром— от 1,5 до 2,5 мкм, с закрепленным на них тонким пористым слоем. В этом случае удается избежать образования застойных зон подвижной фазы, что способствует заметному увеличению скорости массопереноса. Большие или малые молекулы можно разделить в течение нескольких минут. Однако такой тонкий сорбционный слой приводит к очень малой нагрузочной емкости колонки, а противодавление внутри колонки создается значительно больше, чем в случае заполнения колонки пористыми частицами с диаметром 3 или 5 мкм.
Давление на входе в колонку обратно пропорционально квадрату диаметра частиц, таким образом, уменьшение диаметра в 2 раза приводит к четырехкратному возраста- 21.1. ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ 206 нино противодавления. По >той причине испо:ц,зование малых пористых частиц предпочтительнее в болыпинстве случаев, прн ттом разделенно на колонках с пориспамн частицами диаметром 3,5 мьм и с не~тористыми модиФицированными частицами диаметром 1,5 мкм происходит за сравнимое время, но вместе с тем для пориспих наполнизелей входное давление заметно ниже, а рабочая скооосзь ГЛАВА 21, ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ изократического разделения сложных смесей, но в этих случаях используют прием последовательного соединениянескольких колонок.
Монолитные колонки выпускает фирма Мегск КйаА (Дармштадт, Германия, сайт производителя ичьзч.шегск.ое) под коммерческой маркой С)пошойг)з. При разработке новых типов сорбентов для ВЭЖХ пробовали самые различные подходы, кроме того, были предложены сорбенты на основе полимерных материалов, которые можно использовать как при очень высоких, так и низких значениях рН.
Высокие значения рН необходимы при разделении оснований. Прочность частиц кремнеземов обычно ограничивается при рН выше 8, поскольку силанольные связи гидролизуются в этой области рН; с другой стороны при рН ниже 2 они также не устойчивы. Компанией %а1егз Согрога11оп (чОЫЛа~сги.сошш) предложены гибридные частицы на основе кремнезема со слоем полимера (коммерческое название Х1епа). Частицы получают при смешивании двух мономеров с высокой степенью очистки, один из которых образует цепочку 81ОФ а другой — цепочку КБ)О, я где К вЂ” метильный радикал. В полученную структуру включают органосиланольные группы, а затем к ним химическим способом прививают обращенную фазу (например, группы См).
Устойчивость частиц в более кислой среде обусловлена тем, что при их формировании в первую очередь участвуют трифункциональные силаны, а не моно- функциональные. Поскольку основа частицы уже содержит метилсилоксановые группы, то от 30 до 50;4 остаточных силанольных групп связывается и экранируется, что в итоге приводит к уменьшению размывания хроматографическнх пиков. Такие частицы устойчивы и при высоких (выше 11), и при низких значениях рН. П. Карр (Университет Миннесоты) предложил использовать пористые частицы оксида циркоиия ЕТОФ так как они устойчивы в широком диапазоне рН (от 1 до 14) и термостабильны до 200 'С. Эти сорбенты, производимые в настоящ р фр рщщ ~р щщ,~ .~), у направленной полимеризацией из агрегированных коллоидных частиц оксида циркония (размером 1000 А); при этом полученные монодисперсные частицы имеют правильную сферическую форму с диаметром 3 мкм.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
