Г. Кристиан - Аналитическая химия, том 2 (1108738), страница 40
Текст из файла (страница 40)
16). Прибор обладает дополнительными возможностями для идентификации веществ и хорошей разрешающей способностью; кроме того, он оснащен мощным устройством для немедленного сохранения снятых спектров поглощения. Сфокусированный пучок радиационного излучения проходит сквозь ячейку детектора и диспергирующее устройство (например, дифракционную решетку) и поступает на линейку фотодиодов для детектирования. С помощью математического аппарата можно добиться разрешения перекрывающихся спектров и тем самым дополнительно увеличить «разделяющую способность» колонки, если получающиеся хроматографические пики содержат два или несколько аналитов. Флуоресцентные детекторы намного более селективны, чем УФ-детекторы, поскольку только некоторые вещества способны к флуоресценции (см.
гл. 16). По чувствительности флуоресцентный детектор не уступает УФ-детектору, а иногда и немного превосходит его, что определяется пространственным расположением источника возбуждения в конструкции детектора, интенсивностью источника и квантовым выходом флуоресценции. Амперометрический детектор (см. гл. 15) удобен при определении электроактивных веществ и в настоящее время находит новое широкое применение в биохимическом анализе, например, при ВЭЖХ-разделении и определении следовых количеств катехоламинов в веществе мозга. При конструировании приборов для ВЭЖХ важно, чтобы «мертвый» объем между инжектором для ввода пробы и колонкой, а также между колонкой и детектором был минимальным, чтобы минимизировать размывание пиков и достичь максимальной эффективности системы.
Обычно для соединения колонки ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ 2'$2 с детектором используют 20-сантиметровые капилляры из нержавеющей стали. что практически не снижает эффективность хроматографической системы в целом. Внутренний объем ячейки детектора также должен быть минимальным— как правило, около 1 мкл; однако у детекторов для капиллярной жидкостной хроматографии объем ячейки бывает намного меньше микролитра. Ячейка спектрофотометрического детектора обычно имеет Х-образную конфигурацию с кварцевым окном для горизонтального прохождения луча света вдоль потока эффлюента.
Это увеличивает длину оптического пути, повышает светопоглощение и тем самым — чувствительность. Колонки и растворители, применяемые в различных вариантах ВЭЖХ Существует два основных варианта высокоэффективной жидкостной хроматографии — жидкостно-твердофазная, или адсорбциоииаи, и жидкостно-жидкостная, или распределительная. Наиболее часто применяют распределительную нормально-фазовую (НФ) или обрашенно-фазовую (ОФ) хроматографию. Как адсорбционная, так и распределительная ВЭЖХ основаны на различии в полярности растворов, поскольку и сорбируемость, и растворимость определяются полярностью веществ.
Процессы распределения между двумя несмешивающимися жидкостями достаточно чувствительны даже к незначительным изменениям в молекулярной массе аналитов, поэтому их предпочитают использовать для разделения веществ, принадлежащих к гомологическому ряду. С другой стороны, процессы адсорбции чувствительны к стерическим эффектам в молекулах аналитов, и поэтому они удобны для разделения изомеров, имеющих различную пространственную конфигурацию.
Для адсорбционного варианта ВЭЖХ в качестве сорбентов применяют частицы оксидов алюминия или кремния. Высокополярные соединения разделяют, главным образом, в варианте распределительной хроматографии, в то время как неполярные соединения — в варианте адсорбционной хроматографии. Для аналитов средней полярности можно осуществлять оба варианта ВЭЖХ. Соединения можно расположить по увеличению полярности в следующий ряд: углеводороды и их производные < кислородсодержащие углеводороды < соединения-доноры протонов < соединения с ионной связью: КН < КХ < Коз < КОК (простые эфиры) = КСО К (сложные эфиры) = КСОК (кетоны) = КСНО (альдегиды) = КСОИНК (амиды) < КХН, Кто, Кзн (амины) < КСОН (спирты) < Н20 < АТОН (фенолы) < КСОзН (карбоновые кислоты) < нуклеотиды < ТчН КСОО ~ (аминокислоты).
В адсорбционной хроматографии сорбент обычно оставляют неизменным, а полярность элюента увеличивают до тех пор, пока определяемые компоненты не будут элюироваться. Наиболее часто используемые растворители располагаются по увеличению полярности в такой последовательности: легкие бензиновые фракции (гексан, гептан, петролейный эфир) < циклогексан < трихлорэтан < толуол < дихлорметан < хлороформ < диэтиловый эфир < этилацетат < ацетон < н-произвол < этанол < < вода.
В некоторых случаях для элюирования может потребоваться настолько полярный растворитель, что определяемые компоненты могут элюироваться с 21.1. ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ 213 колонки практически одновременно, без разделения. Тогда следует перейти к менее полярному сорбенту. В нормально-фазовом (НФ) варианте хроматографии неподвижная фаза является полярной, а в качестве подвижной фазы используют такие неполярные растворители, как н-гексан, метиленхлорид, хлороформ. Поверхность неподвижной фазы модифицируют силоксанами с полярными функциональными группами в соответствии с увеличением полярности: цианогруппа < диольная группа < аминогруппа < диметиламиногруппа.
Такие сорбенты удерживают преимущественно полярные, а не неполярные соединения. В обращеино-фазовой (ОФ) хроматографии используют относительно не- полярную неподвижную фазу в сочетании с полярными подвижными фазами, такими как метанол, ацетонитрил, тетрагидрофуран, вода, или, еще чаще, смеси воды с органическими растворителями. Органические растворители в этом случае называют модификаторами, чаще всего в качестве модификатора применяют ацетонитрил. Для достижения необходимой полярности варьируют соотношение вода/органический растворитель. Метанол обычно служит для разделения кислотных соединений, а ацетонитрил — для оснбвных соединений.
Тетрагидрофуран используют при разделении веществ с большим дипольным моментом. Эти растворители прозрачны в УФ-области и обладают низкой вязкостью. В качестве неполярных групп на поверхность сорбента прививают и-октадецил (См), и-октил (Сз) или фенильные радикалы. Полярные колонки для обращенно-фазовой хроматографии содержат полизтиленгликоль (ПЭГ) с эфирными группами, которые взаимодействуют с полярными аналитами. Такие колонки используют для разделения органических веществ: фенолов, полиароматических углеводородов или соединений с гидроксильной группой.
При разделении на сорбентах с группами С1з пики таких соединений могут значительно перекрываться. На колонках с ПЭГ следует ожидать обратного порядка элюирования. В водно-органических смесях можно растворять органические соединения различных классов с тем, чтобы затем разделить их в варианте обращенно-фазовой хроматографии, что и делает ОФ ВЭЖХ наиболее применяемым методом.
Если вещества можно разделить как в НФ-, так и в ОФ-вариантах ВЭЖХ, то порядок элюирования обычно обращается, хотя и не всегда на полностью противоположный исходному. Естественно, если образец достаточно неполярный и не растворим в водно-органических смесях, то переходят к нормально-фазовой хроматографии. В обратных случаях используют ОФ ВЭЖХ.
1. Выбор растворителя. В отличие от газожидкостной хроматографии, где газ-носитель в эксперименте оставляют одним и тем же, а варьируют полярность неподвижной фазы для достижения приемлемого разделения, в жидкостно-жидкостной распределительной хроматографии исследователь как раз может варьировать подвижные фазы, или «элюирующую силу» растворителя. Это гораздо легче сделать, чем менять колонки, и выбор подвижной фазы является важной частью разработки методик разделения в жидкостной хроматографии. ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ 214 В большинстве случаев использование чистого растворителя не приводит к эффективному разделению соединений, и тогда переходят к смесям двух или нескольких растворителей. Если обозначить растворитель с меньшей элюирующей силой как А, а с большей — В, то для достижения эффективного разделения надо экспериментально подобрать оптимальное содержание В в смеси.
Нас интересуют при этом два фактора оптимизации разделения: фактор удерживания [г, т. е. параметр полярности, и фактор разделения а, т. е. коэффициент селективности [см. уравнение [19.28)1. Мы будем подбирать растворители с такой элюирующей силой, чтобы все значения [г для всех элюируемых веществ попадали в диапазон от 0„5 до 20. Добиваясь приемлемого удерживания, нельзя забывать о том, что разделение большинства хроматографических пиков должно быть как можно более полным [по возможности до базовой линии).
Если мы добились неполного разделения при содержании растворителя В, например, 35%, то изменив его содержание до 40 или 45%, удается получить лучшее разделение хроматографических зон веществ и, следовательно, улучшить разрешение. Однако это может привести к более значительному перекрыванию зон других компонентов, чем это было при меньшем содержании В. С помощью смеси двух сильных растворителей, например ацетонитрила [АсН) и метанола [МеОН), с водой можно снизить перекрывание хроматографических зон и достичь приемлемого разделения [рис. 21.10). На примере двух первых экспериментов с различным содержанием ацетонитрила АсН в смеси [80 и 40%) продемонстрировано, как можно добиться попадания факторов удерживания в требуемый диапазон при варьировании силы элюента; в случае 40%-го АсН факторы удерживания увеличиваются, но разделение при этом далеко не полное.
Переход от АсН к 50%-му раствору 40% Асм 1О 1О 60% МеОН б 20% Аом + 25% МеОН 10 10 РИС. 21. 10. Эмпирический подход к выбору состава подвижной фазы, начиная от смеси 80% апе- тоиитрила — 20% воды. Из [Ь, к. Впудег, Ь Ь К~гй[апд апо Ь Ь, О[а!с и Ргасиса! НРЬСМегйог1Реге- !ортепг, 2 ' ег[. 1чезг г'огас: 'гч1!еу-!пгегзс[епсе, 1998]. Опубликовано с разрешения 216 21.1.
ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ метанола МеОН позволил полностью разделить неразделенные ранее компоненты, но при этом зоны других веществ начинают перекрываться. Наконец, при использовании смеси двух растворителей (смесь 1: 1 применяемых ранее 40;4-го Асй и 50;4-го МеОН) достигается некоторое «усредненное» разделение при допустимом разрешении пиков. Предложенный эмпирический подход при выборе растворителей работает в большинстве случаев.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
