Г. Кристиан - Аналитическая химия, том 2 (1108738), страница 46
Текст из файла (страница 46)
Экеклюзионные тонкослойные материалы можно приготовить из ЗерЬадех Впрегбпе. Гель вымачивают в воде в течение трех суток до полного набухания, а затем наносят на пластинку. Полученные пластинки не высушивают, а 2П5. ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ сохраняют во влажном состоянии. Скорость движения под действием капиллярных сил через полученные молекулярные сита существенно меньше, чем в тонких слоях других типов, как правило — всего 1 — 2 см/ч, а потому развитие хроматограмм занимает 8-10 ч по сравнению с 30 мин в других неподвижных фазах. Подвижные Фазы для ТСХ В адсорбционной хроматографии наблюдаются те же закономерности, что и в колоночной; злюирующая сила подвижной фазы возрастает с увеличением полярности 1например, гексан < ацетон < спирт < вода).
По возможности в качестве подвижной фазы следует использовать либо одно соединение, или хотя бы двух-трехкомпонентную смесь, поскольку смешанные подвижные фазы имеют тенденцию к изменению состава по мере продвижения вверх по пластинке. Последнее может привести к варьированию значений Я, в зависимости от расстояния, пройденного пятнами на пластинке. Раствор, применяемый в качестве подвижной фазы, должен состоять только из очень чистых компонентов. Присутствие малых количеств воды или других примесей способно повлиять на воспроизводимость хроматограмм. Количественные измерения Широкие возможности двумерной тонкослойной хроматографии по разделению можно сочетать с количественными расчетами, основанными па оптических измерениях плотности хроматографических пятен.
Это можно сделать измерениями либо пропускания света через хроматографическую пластинку, либо отражения света, ослабленного окраской определяемого вещества, а также измерением интенсивности флуоресценцни, полученной при облучении ультрафиолетом.
В настоящее время существуют приборы, способные регистрировать полный спектр сразу при нескольких длинах волн. ВысокоэФфективная тонкослойная хроматография (ВЗТСХ) Возможности тонкослойной хроматографии были расширены разработкой хроматографических приемов, улучшающих скорость и зффективносгь разделения, а также совершенствованием автоматических систем пробоотбора, систем детектирования и способов получения хромагпозрамм ни месше. Использование слоев, состоящих из частиц очень малого размера, приводит к более быстрому и эффективному разделению.
Это происходит ввиду более узкого распределения по размерам частиц со средним диаметром 5 мкм, чем традиционных для ТСХ частиц с диаметром 20 мкм. Применение специализированных механических устройств для нанесения капель образца позволяет улучшить воспроизводимость стартовых пятен при уменьшении их размера. Уменьшение размеров пробы примерно в 10 раз по сравнению с классическими методами ТСХ позволяет во столько же раз сократить время разделения. Наряд> с ТСХ-слоями на основе силикагеля применяют также материалы с химически привитыми фазами, подобные тем, что используют в нормально- и обращенно-фазовой ВЭЖХ. 238 ГЛАНА 21.
ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ Частицы мелкого размера, используемые в ВЭТСХ, замедляют продвижение подвижной фазы даже на сравнительно короткое расстояние. Для устранения данного эффекта применяют методику «форсированного потока», с использованием герметизированных камер. При этом с помощью насоса подвижная фаза с постоянной скоростью поступает через щель в пластиковом покрытии, нанесенном на неподвижную фазу. С подробностями этого подхода можно ознакомиться в работах Калаца и его сотрудников 1Х Сйготагоу . Ясй 18 (1980) 324; СЬ отаго8- гарйга, 18 (1984) 628). Современная тонкослойная хроматография способна служить некоторым дополнением к методам ВЭЖХ. Это позволяет осуществлять параллельную обработку многих образцов, делая доступными серийные определения низкой стоимости для простых смесей при большом числе анализируемых проб.
Пластинки ТСХ играют роль своего рода архива определений в случае их сохранения. 21.6. ЗЛЕКТРОфОРЕЗ В основе электрофоретических методов разделения веществ лежит явление влияния электрического поля на удельные (отношение заряда к массе) заряды этих частиц. Данные методы широко используют для заряженных коллоидных частиц или ионов макромолекул, таких как белки, нуклеиновые кислоты и полисахариды.
Существует несколько разновидностей электрофореза, но наиболее распространенным является зонный электрофорез. В зонном электрофорезе белки взаимодействуют с твердой подложкой, поэтому помимо электрических миграционных сил на эффективность разделения могут влиять также традиционные хроматографические взаимодействия. В зависимости от типа подложек различают семь типов зонного электрофореза. Наиболее распространены подложки на основе гелей крахмала, полиакриламидных гелей, полиуретановых пен и бумаги. Методика проведения электрофореза с использованием гелей крахмала нашла наибольшее распространение (хотя в последнее время ее постепенно вьпесияют методики с применением полиакриламидных гелей, позволяющие уменьшить конвекцию и диффузионные эффекты).
Сначала готовят пластинку с гелем крахмала, затем наносят образец на тонкую полосу (линию) в центре пластины, к концам которой прикреплены электроды посредством контактных мостиков. При пропускании электрического тока через полученную ячейку разделяемые компоненты смеси перемещаются с различными скоростями в зависимости от их заряда, размеров и формы. Во время электрофореза отрицательно заряженные компоненты мигрируют по направлению к аноду, а положительно заряженные — к катоду. В результате получается серия разделенных полос компонентов образца. С помощью зонного электрофореза можно разделять очень сложные смеси.
Например, известно крахмал-гель электрофоретическое разделение белков плазмы, включающей 18 компонентов. С помощью денситометра можно измерить интенсивность полученных окрашенных зон, получив тем самым количествен- 21 т. клпилляРныЙ электРОФОРез 239 ные результаты. Одним из перспективных вариантов подобных злекзрофоретичсских метолов разделения являезся ьапилляриый гель- юектрофорсз. Скороегь миграции каждого всгнсства зависиг ги приложенного напряжения и ог РН буферного раствора. Рабочее напряжение в злектрофорезе выражают в волгпах на сдинипу ллины (обычио В,'смр Обычно напряжение не ипевыигает 242 ГЛАВА 2 Н ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ В чем заключается высокая разрешающая способность КЭ? Особенности электроосмотического потока Трннять сХть различия между хроматографическиы движением иод действием внетането давления в )ЗЭЖХ и злектроосмот.ическим движением в К') можно с.
21.7, КАЛИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ 243 жен превышать 2',4 от общей длины капилляра. При введении пробы под действием силы тяжести конец специального капилляра опускают в образец (объем которого может составлять всего 5 мкл), а затем, через определенное время, после заполнения капилляра пробой, извлекают. Другой подход состоит в опускании капилляра в сосуд, находящийся под давлением для принудительного набора образца в капилляр или же втягивание всасыванием с другого конца капилляра.
После ввода пробы сосуд с образцом заменяют на емкость с буферным раствором. Альтернативный способ введения пробы состоит в погружении капилляра в раствор пробы, а затем кратковременной подаче относительно низкого напряжения, например, 2000 В в течение 10 с. При этом проба вводится под действием электроосмотического потока. Воспроизводимость гидростатических инъекций составляет порядка 1 — 2М. Преимущество электроосмотической инъекции заключается в возможности введения проб большого объема, что способствует снижению предела обнаружения.
Недостатком такого способа введения пробы являются различия в подвижностях ионов, вследствие чего состав раствора, входящего в капилляр, несколько отличается от реального состава пробы. Один из подходов, разработанный для увеличения резкости зоны при электроосмотической инъекции и, тем самым, улучшения разрешения, чувствительности и представительности, заключается в использовании раствора пробы с меньшей ионной силой, чем у разделяющего электролита, который применяют при обычной электроосмотнческой инъекции. В этом случае напряженность поля в зоне образца будет больше, и ионы образца будут быстро мигрировать в направлении капиллярного буфера, пока не достигнут границы электролиты с более слабым электрическим полем.
Эта методика, называемая также «стэкинг», способствует уменьшению ширины зоны вводимой пробы примерно в 10 раз. При этом пробу следует готовить в разведенном (1: 10) водой растворе капиллярного электролита либо (что лучше) в воде. Детекторы в КЭ Детектор помещают вблизи катодного конца капилляра, по которому течет раствор. Чувствительному детектированию мешает малая длина пути через капилляр, но малые пиковые объемы, зачастую меньшие, чем 1 нл, приводят к низким пределам обнаружения даже при использовании детекторов с умеренной чувствительностью (поскольку растворенное вещество концентрируется в малом обьеме). Наиболее часто применяют фотометрический детектор в УФ-области. Сфокусированный пучок лучей проходит через капилляр (там, где удален защитный кожух) и далее собирается линзой а паре с фотоэлектрическим умножителем.
Для увеличения длины пути пучок света располагают под углом к капилляру, при этом он проходит через специальное отверстие в защитном чехле, затем отражается от внутренней поверхности и выходит из капилляра через отверстие на другой стороне. На стенку капилляра можно наносить специальное отражающее покрытие. В капилляр можно вставить проточную ячейку. На рис. 21.22 показано поперечное сечение серийно выпускаемой У-ячейки, в которой луч света с целью увеличения путипроходитвдоль горизонтальной осизкапилляра. Для обнаруже- П1АВА 21.
ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ния флуореспнрующих веществ использукн флуоресцентные лез скторьь 11римененис лазерных исвнников 1флуорссцеш!ия, нндуцируемая лазером) сннжаГн пределы обнаружения до уровня цсптомоля (1О с'), Реже использукзт к~ектрохимические детекторы, такие как кондуктомепзические или амперомщрические. В последнее время становится очень нопулярнь~м 21.7. КАПИЛЛЯРИЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ 246 (21.7) Неее Нер Нее Электрофоретическая подвижность определяется как: г Нер =— бхтр. (21.8) где з — число ионных зарядов растворенного вещества; ц — вязкость раствора; г — ионный радиус. Данная величина принимает положительное значение для катиона и отрицательное — для аннана.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
