Г. Кристиан - Аналитическая химия, том 2 (1108738), страница 50
Текст из файла (страница 50)
Скорость ферментативных реакций будет максимальна при определенном значении рН ввиду существования ряда кислотно-основных взаимодействий, таких как кислотная диссоциация между субстратом, активированным комплексом и продуктами. Максимальная скорость ферментативной реакции может также зависеть от ионной силы и типа используемого буферного раствора. Например, скорость реакции аэробного окисления глюкозы под действием фермента глюкозооксидазы имеет максимальное значение при рН 5,1 в среде ацетатного буферного раствора и уменьшается при его замене на фосфатный буферный раствор при прежнем значении рН. Активность ферментных препаратов различна в зависимости от их источника, поскольку обычно ферменты не очищают до 100',4-й чистоты. По этой причине процентное содержание фермента меняется в каждом заново изготовленном щэепарате.
Активность приготовленных ферментов измеряют в международных единицах (1.П.). Международная единица была введена Международным союзом по биохимии как «.,.количество, которое при определенных условиях катализирует превращение одного микромоля субстрата в минуту». Определенные условия включают температуру и рН. Например, некоторые коммерческие препараты глюкозооксидазы могут иметь активность 30 единиц на миллиграмм. Таким образом, для определения субстрата берется определенное количество единиц фермента.
Под удельной активностью понимают число единиц фермента на миллиграмм белка. Молекулярную активность определяют как число единиц на молекулу фермента, т. е. она представляет собой число молекул субстрата, превращаемых в минуту одной молекулой фермента. Концентрацию фермента в растворе следует выражать числом единиц в миллилитре илн литре, т. е, в активностях, а не в молярных концентрациях.
Ингибиторы и активаторы Ферментов Несмотря на то, что ферменты катализируют только определенные реакции или типы реакций, здесь также возможны влияния со стороны других веществ. При образовании активированного комплекса субстрат адсорбируется на активных центрах фермента. Подобным образом на активных центрах могут адсорбироваться и другие вещества, имеющие сходные размеры и форму. Но после подобных присоединений к ферменту они не будут подвергаться каким-либо превращениям.
При этом они конкурируют с субстратом за активные центры фермента, снижая скорость каталитической реакции. Данное явление называют конкурентным иигибироваиием. Например, фермент янтарная дегидрогеназа специфично ускоряет дегидрирование янтарной кислоты с образованием фумаровой кислоты. Но другие вещества, сходные по строению с янтарной кислотой, могут конкурентно ингибировать эту реакцию. К таким веществам относятся другие дикарбоновые кислоты, например,малоновая и щавелевая.
Конкурентное ингибирование можно снизить увеличением концентрации субстрата по гг.г. фнчивнтятивный втдвиз сравнению с мешающими компонентами — для того, чтобы увеличить вероятность соединений молекул ферментов именно субстратом. Неконкурентное иигибирование встречается в случаях, когда ингибирующий эффект зависит только от концентрации самого ингибитора. Обычно оно обусловлено адсорбцией ингибитора на центрах, отличных от активных, но тем не менее участвующих в активации. Другими словами, образуется неактивная форма фермента. Примером могут послужить реакции тяжелых металлов, таких как ртуть, серебро и свинец, с сульфгидрильными группами ( — БН) на поверхности молекул фермента. Дело в том, что сульфгидрильные группы необратимо связываются тяжелыми металлами (ЕБН -~ Ад+ -+ ЕБАя + Н'). Именно по этой причине тяжелые металлы являются ядами для организма. Некоторые ферменты требуют присутствия определенных металлов для активации, возможно, для образования комплексов определенной стехиометрии.
Любое вещество, способное к комплексообразованию с ионами металлов, может выступать затем в качестве ингибитора. Например, катионы магния являются активатором для большого числа ферментов. Оксалат- и фторид-ионы могут образовывать с катионом магния комплекс, становясь ингибиторами.
Активаторы ферментов иногда называют коферментами. Ингибироваиие субстрата иногда встречается в случаях, когда субстрат присутствует в избыточном количестве. В таких случаях реакция замедляется после достижения максимальной скорости. Полагают, что причиной данного явления является сильная конкуренция молекул субстрата за активные центры на поверхности фермента, при которой происходит блокировка центров с предотвращением занятия мест другими молекулами субстрата. Константа Михаалиса Как уже было упомянуто, при заданной концентрации фермента и по мере возрастания концентрации субстрата фермент становится насыщенным по отношению к субстрату и скорость реакции достигает максимального значения Я,„ Уравнение Лайнуивера — Берка описывает взаимосвязь каталитической эффективности фермента с максимальной скоростью реакции: (22.
14) где К вЂ” константа Михаэлиса, которая является мерой активности фермента. С использованием уравнения (22.12) можно показать, что К = (аз + кз)йг Константа Михаэлиса равна концентрации субстрата, соответствующей половине максимальной скорости реакции, Я,„/2, что можно проиллюстрировать с помощью уравнения (22.14) путем подстановки в него Я = Р „!2. График зависимости 1Д1 от ЦБ1 представляет собой прямую, имеющую тангенс угла наклона, равный К /Я,„, и свободный член, или отсекаемый осью ординат отрезок, равный 1Я .
Используя это, можно определить константу Михаэлиса как характеристику субстрата и фермента. гдава ю. кинничесиие мноды аналиэд Пример 22.1 В результате ферментативной реакции были получены следуквцие изменения оптической плотности в зависимости от концентрации субстрата: )$1. моль'л Я, зА~'мин 22.2. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ Специфичность ферментативных реакций Существуют четыре типа специфичности реакций с участием ферментов: (1) абсолютная специфичность, в случае, когда фермент катализирует одну единственную реакцию; (2) групповая специфичность, при которой фермент взаимодействует только с молекулами, содержащими определенные функциональные группы, например, амино-, фосфатные или метильные группы, (3) специфичность по типу связи, при которой фермент действует лишь на соединения, имеющие определенный тип химической связи; (4) етереохимическая специфичность, при которой фермент взаимодействует с определенными пространственными или оптическими изомерами.
Помимо субстрата, на который они действуют, многие ферменты требуют наличия дополнительного (второго) субстрата Вторые субстраты могут акгивировать многие ферменты и являются частным случаем кофактора или кофермента (описано выше). В качестве примера здесь можно привести никотинамидаденин- и в 2 Рис. 22.3 Иллюстрация зависимости константы Михвэлисв от скорости реакции. К =([8] цри12 12): кривая 1 соответствует малым значениям К„; кривая 2 — большим значениям К„ О о к., к~, (8)— Физический смысл К наглядно проиллюстрирован на рис.
22.3 (зависимости на котором аналогичны зависимостям на рис. 22.2). Когда скорость реакции резко возрастает с увеличением концентрации субстрата, значение К невелико (кривая 1). Субстрат, дающий для данного фермента наименьшее значение К, зачастую (но не обязательно) является его природным субстратом, что и является причиной резкого увеличения скорости реакции по мере увеличения концентрации субстрата. Малые значения К показывают, что фермент приходит в насыщение при малых концентрациях субстрата. Напротив, большие значения К свидетельствуют о том, что для достижения высоких скоростей реакции требуются высокие концентрации субстрата. В этом случае сложно добиться зависимости нулевого порядка по субстрату, а сам субстрат не будет подходящим реагентом для определения фермента.
ГЛАНА сс. КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА 2аз4 динуклеотид (ХАН ), который является кофактором во многих реакциях с участием дегидрогеназы, выступая в качестве акцептора водорода: (22. 15) где БН вЂ” восстановленная форма субстрата, Я вЂ” его окисленная (дегидрированная) форма, ХАЕН вЂ” восстановленная форма НАТ1+. (ХАРс является наиболее распространенным кофактором в анализах клинических лабораторий, За течением реакции наблюдают, измеряя концентрацию ХАТ)Н.) Номенклатура ферментов Ферменты классифицируют в соответствии со специфичностью их реакции, а также их субстратной специфичностью.
Названия большинства ферментов имеют окончание «азал. В зависимости от типа катализируемой реакции, ферменты подразделяют на четыре группы: (1) те, что катализируют присоединение воды (гидролазы) или ее удаление (гидразы). Гидропазы включают в себя эстеразы, карбогидразы, нуклеазы и деаминазы, в то время как гидразы — угольную ангидразу и фумаразу; (2) те, что катапизируют реакции с участием электронных переходов: оксидазы и дегидрогеназьц (3) те, что катализируют перенос радикалов, например, трансаминазы (перенос аминогрупп), транеметилазы (перенос метильных групп) и трансфосфорилазы (перенос фосфатных групп); (4) те, что катализируют разрыв и образование С вЂ” С-связей: десмолазы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
