Г. Кристиан - Аналитическая химия, том 2 (1108738), страница 51
Текст из файла (страница 51)
Например, а-глюкозидаза действует на любой и-глюкозид. Дпя разных глюкозидов скорость реакции может быть различной. Тем не менее, ферменты обычно проявляют абсолютную специфичность лишь к одному субстрату. Таким образом, глюкозооксидаза катализирует аэробную реакцию окисления глюкозы до глюконовой кислоты и пероксида водорода. глмкозоокснказа с,н„о, о, + н,о с,н„о, н,о, (22.16) Данный фермент является почти полностью специфичным по отношению к ~3-Т1-глюкозе, при этом а-0-глюкоза реагирует со скоростью 0,64 по сравнению с 13-формой, для которой скорость принимают за 100.
Это объясняется тем, что в ~3-форме глюкозы все атомы водорода расположены в аксиальной плоскости, а гидроксильные группы — в экваториальной, ввиду чего ее молекула беспрепятственно присоединяется к активному центру фермента с образованием фермент- но-субстратного комплекса. Однако в а-форме расположение атомов водорода и гидроксильных групп иное, что не дает возможности ее молекуле подойти к активным центрам фермента вплотную. Таким образом, аэробное превращение глюкозы (обычно на 36% состоящей из а-формы и на 64% — из )3-формы) зави- 22.2. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ 265 сит от степени мутаротации а-формы в р-форму. Равновесие мутаротации смещается по мере расходования Д-формьь На этот процесс можно воздействовать с помощью другого фермента — мутаротазы, но в нем обычно не возникает необходимости. Известно, что глюкозооксидаза действует также и на другое вещество — 2-дигидрокси-ТЭ-глюкозу.
Тем не менее, относительная скорость этой реакции на порядок меньше скорости превращения Д-глюкозы, и обычно она не влияет на результаты определения глюкозы в крови. Существуют тысячи природных ферментов и большинство из них проявляют абсолютную специфичность. Определение ферментов Ферменты можно определять, измеряя количество превращенного субстрата или продукта, полученного в результате ферментатнвной реакции за определенный промежуток времени.
Для того, чтобы скорость реакции зависела только от концентрации фермента, субстрат должен находиться в избытке. т. е. реакция должна иметь псевдонулевой порядок. Результаты определения ферментов выражают в международных единицах. Например, активность препарата глюкозооксидазы можно определить путем манометрического или амперометрического измерения числа микромолей кислорода, потребляемого в единицу времени. С другой стороны, оказалось чрезвычайно полезным использование ферментов для разработки специфичных методик определения субстратов, особенно в клинической химии. В этом случае необходимо, чтобы скорость реакции была прямо пропорциональна концентрации субстрата, потому фермент берут в заведомо избыточном количестве.
Определение субстратов ферментов Для определения ферментных субстратов можно использовать две основные методики. Во-первых, можно добиться полного превращения субстрата. С этой целью измеряют концентрацию продукта ферментативно-каталитической реакции или же расходование реагента, изначально взятого в избытке. Затем концентрацию определяемого вещества пересчитывают в искомую концентрацию субстрата.
Зачастую такие реакции нестехиометричны по отношению к субстрату ввиду наличия побочных реакций нли же нестабильности продуктов и реагентов. Помимо этого, для завершения реакции может потребоваться очень много времени. В таких случаях при аналитических измерениях обычно строят специальную градуировочную зависимость, в которой измеряемый параметр связан с известными концентрациями или численными характеристиками субстрата.
Другой подход, используемый для определения субстратов, состоит в измерении скорости ферментативно-каталитической реакции, как и в случае определения активности ферментов. Это можно сделать одним из трех способов. Во-первых, можно измерять время, необходимое для образования в процессе реакции заданного количества продукта, или же время, требуемое для расхода за- 2В6 ГЛАВА 22. КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА Пример 22.2 Содержание этанола в крови человека определяют по ферментативной реакции с участием МАР+ по превращению последнего в МАРН под действием алкогольдегидрогеназы (табл.
22.1). Скорость образования МАРН измеряют при длине волны, равной 340 нм (рис. 22.4). Для стандартного раствора, содержащего 0,1% (масса: объем) этанола, и образца неизвестного содержания в результате проведения данной реакции получены следующие значения оптической плотности: станк нензв 0,004 0,052 0,099 0,147 0,201 0,245 0 20 40 60 80 100 0,003 0,036 0,070 0,098 0,132 0,165 Используя электронные таблицы, определите скорость изменения оптической плотности и искомую концентрацию.
* Так называемый метод фиксированной концентрации. — Прим. иерее. Так называемый метод фиксированного времени. — Прим, иерее. Так называемый метод тангеисов. — Прим. иерее. данного количества субстрата'. Во-вторых, можно измерять количество израсходованного субстрата или же полученного в результате реакции продукта в течение фиксированного промежутка времени'* (см. практическую работу № 35 по определению глюкозы). Третий подход состоит в постоянном измерении концентрации продукта или субстрата в зависимости от времени, с целью определения значения тангенса угла наклона графика скорости реакции Ас/АТ *. Этот подход также известен как измерение «истинной» скорости реакции.
Подобные измерения следует проводить на ранних этапах реакции, где она имеет псевдопервый порядок. Измерения скорости обычно более экспрессны, чем вышеописанные методы фиксированных времен и концентраций или же методы полного превращения. С другой стороны, реакции полного превршцения меньше подвержены мешающему влиянию со стороны активаторов или ингибиторов, до тех пор, пока для полного превращения есть достаточно времени.
Различные подходы к определению субстратов описаны также в гл. 13, где затрагиваются вопросы использования ферментативных электродов. 267 Реаеение Г1Гла л 22.2. ФЕРМЕНТАТН8НЫЙ КАТАПИЗ А 1 Т.с лТ„„, за ала"а",ол фола лелаТ :2 0 0004 0 Е Е, 6 А„,„, за отчетом Фона аллалТ ГЛАНА яс. КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА 288 Рис. 22.4 я й 12 о 1,0 И о,в й 0,6 $ 0,4 0,2 О О 0 Ультрафиолетовые спектры поглощения ХАРк и ХАРИ (любезно предоставлено Туси)т(пкЮп ВюсЬею(са( Сотрога1юп) 260 300 340 380 400 Длина волны, нм денни диагноза инфаркта миокарда. В данном случае ХАР' требуется для ката- л изируемой ферментом ЬРН реакции окисления молочной кислоты в лиро виноградную; СН, тон С =О + ХАРН + Н' 1 СО,Н СНт ! СНОН + ХАР' СО,Н (22. 17) молочная кислота пировинотрадная кислота Эта реакция обратима и может протекать в обоих направлениях. В прямой реакции к сыворотке, содержащей неизвестное количество 1РН, добавляют раствор, содержащий достаточную для насыщения фермента концентрацию молочной кислоты и ХАР, а затем измеряют увеличение оптической плотности при 340 нм в зависимости от времени.
Помимо этого, ХАРН используют для сопровождения некоторых ферментативных реакций без непосредственного в них участия, где он выступает в качестве связывающего реагента во вторичной реакции с продуктом. Например, сыворотка глютаминовой оксацетиновой трансамнназы (ООТ) катализирует реакцию с участием а-кетоглутарата и аспарата, при этом продукт восстанавливается ХАРН в присутствии другого фермента — дегидрогеназы яблочной кислоты (МРН): СОТ а-Кетоглутарат о аспарат = глутамат+ оксалоацетат (22.18а) МОН Оксалоацетат 4- ХАРН = малат + ХАР+ (22.18б) При избытке МРН вторая реакция протекает гораздо быстрее первой, а потому скорость уменьшения концентрации МАРН прямо пропорциональна активно- сти ООТ.
2. Наиболее часто определяемые субстраты. Список некоторых субстратов, определяемых в крови или моче, приведен в табл. 22.1. Их обсуждению посвя- щены последующие разделы. 22.2. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ 'вАТАЛИЗ Таблица 22.1 Примеры наиболее часто применяемых фермеитатмвных реакций для определения субстратое а клинической химии Определяемый субстрат Реакция Фермент 0 )ЧНз — С вЂ” )ЧН + НзΠ— » 2ХНз -Ь СОт Мочевина Глюкоза Уреаза Глюкозооксидаза СоНпОн+Н)О ' От — +СзНз,От+НтО) Гглюкоза) (глюконоват «валата) Мочевая кислота Урнказа С,Н40, ч 2Н,О + О, -+ С4НоО))т)4 + СО, + Н,О, )мочалка Июлантонн) кнслота) Р-гацаятоза+ 0 -о Р-галаятогексодиальлоза+ Н 0 Галактозооксидаза Галаятоза Уреаза — первый фермент, выделенный в чистом виде и полученный в кристаллическом состоянии. Он количественно переводит мочевину в аммиак и диоксид углерода.
Количество мочевины рассчитывают исходя из количества образовавшегося в реакции аммиака или (реже) диоксида углерода. Продукт определяют спектрофотометрически по реакции аммиака с фотометрическим реагентом. Глюкозу обычно определяют по количеству пероксида водорода, полученного по реакции, каталнзнруемой глюкозооксидазой. Измерения проводят спектрофотометрически: реакцию связывания образующегося в реакции пероксида водорода реагентом типа о-толуидина проводят в присутствии второго фермента — пероксидазы хрена, в результате чего образуется окрашенный продукт.
Коммерческие препараты глюкозооксидазы обычно содержат примеси, реагирующие с пероксидом водорода и тем самым нарушающие стехиометричность процесса. Примесный фермент, ответственный за распад пероксида водорода, называется каталазой. Тем не менее, процент пероксида водорода, переходящего в окрашенный продукт, остается постоянным, а потому можно построить градуировочные зависимости на основании измерений с различными концентрациями глюкозы.
За ходом реакций с участием оксидазы наблюдают измерением потребляемого 02 или же скорости образования Н20г Существует множество веществ, способных выступать в качестве ингибиторов при определении глюкозы, но большинство из них встречается во второй ферментативной реакции. Метод с применением глюкозооксидазы мог бы быть более специфичным, если бы концентрацию пероксида водорода определяли без использования второго фермента.
Например, иодид-ионы в присутствии катализатора на основе молибдена(У)) быстро окисляются до свободного иода. Концен- Этанол в крови Алкогольдегидрогеваза Этанол ь ХАР -+ ацетальдегид + )ч)АРН + Н+ ГЛАВА 22. КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА 270 трацию иода можно определять амперометрически (см. гл. 15). Другой способ заключается в амперометрическом определении количества потребляемого кислорода.
Мочевую кислоту определяют путем измерения светопоглощения в ультрафиолетовой области при 292 нм. Однако содержание мочевой кислоты в крови невелико, и светопоглошение в этой части спектра неселективно. Поэтому после измерения мочевую кислоту разрушают добавлением фермента уриказы. Затем повторно измеряют оптическую плотность. Количество мочевой кислоты, присутствующей в образце, определяют ио разности полученных значений. Данный метод является селективным, поскольку уриказа действует лишь на мочевую кислоту. Похожие методики фотометрического определения мочевой кислоты состоят в окислении мочевой кислоты молибдатом с образованием молибденовых синей — соединений молибдена(Ч).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
