Г. Кристиан - Аналитическая химия, том 2 (1108738), страница 52
Текст из файла (страница 52)
В принципе определение мочевой кислоты можно проводить по аналогии с определением глюкозы, но примеси в препарате уриказы обычно быстро разлагают пероксид водорода, образующийся в очень малом количестве. Галактозу определяют тем же методом, что и глюкозу, окисляя хромоген пероксидом водорода в присутствии пероксидазы. Содержание этанола в крови определяют измерением образующегося в реакции АРАОН по светопоглощению в ультрафиолетовой области. 3.
Наиболее часто определяемые ферменты. В табл. 22.2 приведены основные реакции, используемые при определении активности некоторых ферментов, наиболее часто определяемых в клинической лаборатории. Для определения пирувата, образующегося в ОРТ-реакции, проводят его реакцию с )ЧАПН в присутствии ЬПН. СК катализнрует перенос фосфатной группы от креатининфосфата к нуклеотиду аденозиндифосфата (АПР) с образованием аденозинтрифосфата (АТР). АТР реагирует с глюкозой под действием фермента гексокиназы с образованием глюкозы-б-фосфата, который может вступать в реакцию с ХАР+ в присутствии глюкозы-б-фосфодегидрогеназы. В настоящее время СК определяют также методами высокоэффективной жидкостной и ион-эксклюзионной хроматографии или электрофореза.
Природный фермент ТОН состоит из пяти компонентов, называемых изофермеитами, соотношение которых зависит от источника ткани, из которой он получен. Два наиболее электрофоретически подвижных компонента встречаются в большом количестве в ЬПН из сердечной мышцы, и их содержание в крови возрастает при повреждениях последней. С помощью?Л)Н-методики определяют суммарное количество изоферментов (,ПН, превышенное значение которых обычно свидетельствует о повреждении сердечной мышцы. Однако две упомянутые формы изоферментов более склонны катализировать реакцию восстановления а-кетобутирата, чем менее подвижные компоненты печеночного происхождения, которые называют активными по а-гидроксибутиратдегидрогеназе (НВП). С помощью этой реакции можно определять НВП, что является более показательным при инфарктах миокарда, чем ЬПН (так как они остаются в активной форме в течение долгого времени с момента инфаркта).
22.2. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ 271 Обозна- чение Фермент Реакция сот Глютаминопиро- ОРТ а-Кетоглутарат ч Т.-алании = глютамат+ пируват виноградная , |лн трансамнназа Пнруват+ ХАОН+ Н' = лактат+ХАО' сот ООТ а-Кетоглутарат ч аспартат = глютамат+ оксалоацетат „мон Оксалоацетат+ ХАОН «Н" = мацат+ ХАО' Глютамнн- оксалоацетат- трансамнназа ск Креатннннфосфат+ АОР = креатнннн+ АТР гексекннааа АТР+ глюкоза АОР+ глюкозо-6-фосфат Глюкозо-6-фосфат + ХАО' — — » 6-фосфоглюконат + ХАОН + Н" е с-брпн , ьпн Т.-лактат ч ХАО' — пнруиат + ХАОН + Н' Креатнннн- фосфокнназа СК Лактат- 1.0Н легндрогеназа нво а-Гндрокси- НВО а-Кетобутират+ ХАОН+ Н" = а-гидрокснбутират+ ХАО' бутират- дегндрогеназа рн ны Тнмалфталеинмонофесфат натрия — + тимолфталенн натрия + фосфат Щелочная фосфатаза Та же, что н а случае щелочной фосфатазы, но РН 6,0 Кислая фосфатаза Фосфатазы определяют, измеряя интенсивность голубой окраски тимолфталеинов в сильнощелочных растворах через определенный промежуток времени.
Сильношелочная среда останавливает ферментативные реакции. Конечно, измерять параметры ферментативных реакций можно не только спектрофотометрически. Существуют методики с использованием амперометрических, кондуктометрических, кулонометрических и вольтамперометрических измерений, а также с применением ионселективных электродов. Характеристики некоторых ферментативных реакций можно определять с помощью ферментативных электродов, отклик которых специфичен для определенной реакции (подробное описание приведено в гл.
13 и 15). Активаторы и ингибиторы ферментов можно определять с использованием реакций с их участием. Простейшая методика состоит в измерении соответствующего увеличения или уменьшения скорости ферментативной реакции. Другой подход заключается в «титровании» фермента ингибитором (нли наоборот) и определении количества ингибитора, требующегося для полного ингибирования реакции. Например, ингибированием или активацией ферментативных реакций можно определять некоторые микроэлементы. Таблица 22.2 Примеры ферментов, наиболее часто определяемых в клиническом анализе ГЛАВА 22.
КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА 272 Многие ферменты являются идеальным воплощением мечты аналитика об абсолютно специфичном реагенте, но из-за наличия ингибирующих эффектов, а также проблем, связанных с необходимостью контроля рН и ионной силы, их следует использовать с некоторой осторожностью. Большинство вышеописанных методик можно приспособить к системам автоматического мониторинга с применением ферментативных анализов. Примеры этого приведены в ссылке 7.
Что мы знали из этой главы? ° Реакции первого порядка, их период полупревращения 1основные уравне- ния (22.3), (22.4)1 — стр. 254 ° Реакции второго порядка, их период полупревращения 1основные уравне- ния (22.7), (22.8)1 — стр. 256 ° Ферментативный катализ — константа Мнхаэлиса 1основное уравнение (22.14)), расчеты с использованием электронных таблиц — стр. 257, 261 ° Определение субстратов (табл.
22.1), определение ферментов (табл. 22.2)— стр. 267 Вопросы Общая теория 1. В чем различие между реакциями первого и второго порядка? 2. Что такое период полупревращения реакции? Сколько периодов полупревращения потребуется для полного завершения реакции? Э. Что такое реакция псевдопервого порядка? 4.
Предложите способ определения принадлежности реакции между веществами А и В к реакциям первого или второго порядка. Ферменты 8. Что такое международная единица? 8. В чем разница между конкурентным и неконкурентным ингибированием фермента? 7. Почему ионы тяжелых металлов ядовиты для организма? 8. Что такое коферменты? 9. Предложите способ проверки того, является ли ингибитор фермента конкурентным или неконкурентным. 10.
Как с помощью графика Лайнунвера — Берка можно определить тип ингибитора (конкурентный или неконкурентный)? Задачи Кинетика Ферменты 16. Задача для решения при помощи электронных таблиц 17. 12. 13. 14. Если в реакции первого порядка 50%-я степень превращения достигается за 10 мин, то сколько времени потребуется для 90%-го превращения? Для 99%-го? Реакции первого порядка требуется 25 с для 30%-го превращения в продук- ты. Каков ее период полупревращения? Реакция, протекающая в 0,1 М растворе веществ А и В, относится к реакци- ям второго порядка. Чему равен период ее полупреврашения при условии, что за 6,75 мин она протекает на 15%? Чему будет равен период ее полу- превращения в случае, когда концентрации А и В одинаковы и равны 0,2 М, и сколько потребуется времени для протекания этой реакции на 15%? Сахароза гидролизуется до глюкозы и фруктозы: С„Н„Оц+ Н,О -+ С,НыО, + С,НыО, В разбавленном водном растворе концентрацию воды можно считать практически постоянной, поэтому данная реакция имеет псевдопервый порядок и подчиняется законам кинетики реакции первого порядка.
Через какое время количество образовавшихся глюкозы и фруктозы будет равно половине концентрации не успевшей прореагировать сахарозы, если в течение 9 ч гидролизуется 25% 0,5 М раствора сахарозы? Пероксид водорода разлагается по реакции второго порядка: Сколько времени потребуется при нормальных условиях для получения 100 мл Оз из 100 мл 0,1 М раствора НзОп если за 8,6 мин разлагается 35% 0,1 М раствора? Активность препарата глюкозооксидазы определяют, измеряя объем потребляемого кислорода в зависимости от времени. Препарат в количестве 10 мг поместили в насыщенный кислородом раствор, содержащий 0,01 М глюкозы.
Далее определили, что при нормальных условиях спустя 20 мин было израсходовано 10,5 мл кислорода. Рассчитайте активность данного препарата, выразив ее в ферментных единицах/мл. Если активность чистого фермента равна 61,3 единицы/мл, какова чистота препарата, выраженная в процентах? Только что разрезанное яблоко на воздухе начинает темнеть вследствие окисления содержащихся в нем фенолов, катализируемых ферментом ГЛАВА 22. КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА 274 о-дифенилоксидазой. Быц проведен эксперимент по определению константы Михаэлиса о-дифенилоксидазы. Для этого свежие кусочки яблока сначала измельчают, затем центрифугируют, а полученную нацосадочную жидкость применяют в качестве источника фермента !см. счсч х .
ийгапет.сош/ -11с)шЬа!!/В!о!о8уРа8ез/Е/ЕпгушеК!пет1св. Ьнп!). В качестве субстрата используют пирокатехин. Измеренное количество ферментного препарата помещают в трубку, содержащую 0,3 мМ пирокатехина, и в течение нескольких минут измеряют разность оптической плотности при 540 нм с интервалом в 1 мин. Эксперимент повторяют с тремя другими трубками, содержащими 0,6, 1,2 и 4,8 мМ пирокатехина. Были получены следующие результаты ГмМ пнрокатехина / АА/мин): 0,3/0,020; 0,60/0,035; 1,20/0,048; 4,8/0,081. Рассчитайте значение К с помощью электронных таблиц.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
