Г. Кристиан - Аналитическая химия, том 2 (1108738), страница 47
Текст из файла (страница 47)
Число теоретических тарелок определя- ется тремя факторами: ,/ Нее~ 2Р (21.9) где 7' — напряжение, приложенное к ячейке; 27 — коэффициент диффузии растворителя, смз/с. Таким образом, число теоретических тарелок увеличивается с ростом напряжения. Большие молекулы, такие как молекулы белков и нуклеотидов, имеют очень малые коэффициенты диффузии, что позволяет получать для них значения Л/порядка нескольких миллионов. Стоит отметить, что в отличие от хроматографии число теоретических тарелок не зависит от длины колонки, поэтому для получения высоких значений Л/ можно использовать большие напряжения с большими длинами колонок.
Пример 21.3 Для капиллярной колонки длиной 50 см и рабочем напряжении 30000 В общая подвижность для 10-минутной миграции равна 2 10-з мз/(В с). Определите число теоретических тарелок для иона Ь|е (Т1 = 1,0 - 10-э мз/с) и молекулы белка с относительной молекулярной массой 100 000 с коэффициентом 27 = 3 10-и мз/с. Решение Для иона 1л+: 2.10 з м~/(В.с) 30000 В 300 000 т. т. 2 (1,0 10 ~ м /с) Величина и практически равна и, поскольку скорость потока постоянна по всей длине колонки.
Общая подвижность растворенного вещества Н„„равна сумме электрофоретической подвижности Н, и скорости электроосмотического пото- ка Нкс ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ 246 Для молекулы белка: (2 10 м I(В с) 30000  — 10 000 000 т. т. 2(3.10 м !с) Скорость миграции г иона в электрическом поле является функцией длины колонки Е: )тле~Е )тем (21.10) где Š— напряженность электрического поля (В7см).
Время достижения детекто- ра 1 равно отношению расстояния от ввода пробы до детектора 1о к скорости: )о )оь г И„„Р (21.11) В слУчае, если детектоР Расположен на конце капиллЯРа, Го = Езl(1з„„р). Таким образом, для быстрых разделений к колонкам малой длины мы должны применять большие напряжения. На скорость миграции влияет температура„поскольку в уравнение (21.8) входит вязкость, которая уменьшается с повышением температуры. Скорость электроосмотического потока можно определить с использованием нейтральной молекулы-маркера, например, метанола, ацетона или бензола, по времени, необходимому для достижения ею детектора: 1 1з ео Его (21.12) Далее, используя уравнение (21.7), можно определить электрофоретическую подвижность иона.
На скорость электроосмотического потока влияет величина дзета-потенциала, который является функцией рН. Возможности КЭ для разделения и его чувствительность проиллюстрированы на рис. 21.23. Смесь из 18 аминокислот разделяется за 30 мин, при этом количества разделяемых компонентов составляют от 2 до 7 аттомоль. Аминокислоты переводят во флуоресцирующее состояние по реакции с изотиоцианатом флуоресцеина (ФИТЦ) и далее используют флуориметрический детектор. Пределы обнаружения составляют от 1О-зс моль в 1 нл, что соответствует 10 " М и б000 молекул! Мы видим, что для молекул белка число теоретических тарелок в 30 раз больше! Однако на практике обычно не удается достичь столь высоких чисел теоретических тарелок ввиду наличия факторов, вызывающих размывание полос. К ним относятся: ширина полосы вводимой пробы, наличие некоторого тепловыделения в капилляре, «мертвый» объем детектора и т.
д. В обычных анализах чаще всего достигают значений около 100 000 и лишь изредка порядка 1 миллиона. 21.7. КЯЛИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ .я о о Ф к о Ф К 2О 18 Время, мин 14 22 Разделение ионов малого размера методом КЭ Капиллярный электрофорез является достойной альтернативой ионной хроматографии и атомно-абсорбционной спектрометрии при количественном определении неорганических ионов вследствие возможности совместного определения нескольких ионов, экспрессности, высокой разрешающей способности и чувствительности при относительно малой стоимости.
Из-за относительно высокой электрофоретической подвижности малых ионов продолжительность их определения можно сократить, заставив двигаться зги частицы в направлении электроосмотического потока. В случае катионов методика не требует никаких изменений, поскольку они перемещаются в том же направлении и имеют очень малые времена миграции.
В то же время малые однозарядные ионы будут иметь меньшую скорость миграции, чем большие однозарядные. Однако из-за большой электрофоретической подвижности маленьких ионов их общая скорость будет замедлена, поскольку электрофоретические силы будут уносить их в направлении от детектора. В случае анионов стенки капилляра могут быть модифицированы алкиламмониевыми солями К4Ь1+, например, бромидом цетилтриметиламмония. Положительно заряженные группы К4Х+ прикрепляются к поверхности с отрицательно заряженными силанольными группами с образованием двойного анионного слоя, что вызывает обращение злектроосмотического потока (по направлению к аноду).
При этом детектор помещают со стороны анода. Другой подход в случае анионов сводится к работе при низких значениях рН, когда силанольные группы не ионизированы и электрофоретическая миграция происходит преимущественно в направлении анода. РИС. 21.23. Разделение 18 аминокислот при их концентрации 2 — 7 аттомоль методом капилляриого зонного элекгрофореза лод действием потенциала 25 кВ с использованием буферного раствора с рН 10.
Ввод пробы осуществляется в течение 10 с при 2 кВ. Аминокислоты: 1 — аргинии, 2 — лизин; пики, связанные с раствором реагента: 3 — лейцин, 4 — изолейцнн, 5 — триптофан, б — метиоиии, 7 — фенилалаиин, валин, гистидии и пролин, 8 — треонии, 9 — серии, 10 — цветени, 11 — алании, 12 — глицин, 13 — тирозин, 14 — глутаминовая кислота н 15 — аспарагииовая кислота [Ы. Л 13оч1сЬ1 и Х.
Р. СЬеп8, Аш. ВлмесЛ. 7аЬ, РеЬшиу (1989)1. Опубликовано с разрешения 248 ГЛАВА 21 . ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ Разделение нейтральных молекул". мицеллярная электрокинетическая хроматография Мы уже упоминали о том, что нейтральные молекулы под действием электроосмотических сил мигрируют с одинаковой скоростью, вследствие чего не могут быть разделены с помощью капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ). Но если ввести в подвижную фазу анионное поверхностно-активное вещество, способное к образованию мицелл, например додецилсульфат, появится возможность разделения и нейтральных молекул.
При превышении определенной концентрации, называемой критической концентрацией мицеллообразования (ККМ), молекулы ПАВ становятся способными к самоагрегации с образованием мицелл, в которых гидрофобные хвосты обращены внутрь, образуя неполярное ядро. При этом отрицательно заряженные ионогенные группы располагаются с внешней стороны мицеллы. Нейтральные молекулы будут распределены между мицеллами и буферным раствором, так же как это наблюдается в ВЭЖХ, причем разные молекулы будут взаимодействовать по разному. Поскольку мицеллы имеют отрицательный заряд, они будут электрофоретически мигрировать по направлению к аноду, в то время как основной поток под действием электроосмотических сил устремится к катоду, но с меньшей скоростью.
Необходимо учитывать, что нейтральные молекулы будут перемещаться со скоростью электроосмотического потока, при этом их движение будет замедляться после прихода в равновесие с мицеллами. Таким образом, чем дольше нейтральные вещества пребывают внутри мицелл, тем больше времени им потребуется до достижения детектора.
Данная методика получила название мицеллярная электрокинетическая хроматография (МЭКХ). Она представляет собой разновидность хроматографии, в которой мицеллы выполняют роль псевдостационарной фазы, и на движение катионов влияют электростатические взаимодействия с заряженными мицеллами. МЭКХ является ценным методом разделения таких нерастворимых в воде нейтральных веществ, как стероиды. Капиллярная злектрохроматография Гибридный метод, сочетающий возможности капиллярного электрофореза и ВЭЖХ, носит название капиллярная электрохроматография (КЭХ) и используется для разделения нейтральных молекул.
При этом капилляр заполняют обращенно-фазовыми частицами, например, частицами силикагеля Сж диаметром 1,5 — 3 мкм. Поскольку при электроосмотическом прокачивании внешнее давление не требуется, частицы могут быть очень мелкими. Также можно применять колонки большой длины. Перемещение полярной подвижной фазы под действием электроосмотического потока более предпочтительно, чем под действием внешнего давления. В качестве несущего буфера обычно используют раствор, содержащий от 40 до 80% органического растворителя, такого как ацетонитрил ЧТО ЫЫ УЗНАЛИ ИЗ ЭТОЙ ГЛАВЫ? 249 или метанол.
Подобно ВЭЖХ, разделение основано на распределении растворенных компонентов между подвижной и неподвижной фазами. В результате электроосмотического прокачивания получается плоский профиль потока вместо параболического, что приводит к более узким пикам и высоким эффективностям разделения (разрешающая способность КЭХ вдвое больше, чем ВЭЖХ). Объемы проб могут быть очень малыми. Метод КЭХ при использовании колонок тех же длин и таких же размеров частиц, что и в методе ВЭЖХ, обычно дает вдвое большее число теоретических тарелок.
Сочетание же в КЭХ частиц малого размера с колонками большей длины делает возможным получение колонок с числом теоретических тарелок от 100 000 до 500 000 по сравнению с 25 000 в ВЭЖХ. КХ является достоверной хроматографической методикой, удобной для разделения биомолекул. В методе КЗЭ, где зачастую также достигаются большие числа теоретических тарелок, при увеличении размера частиц уменьшаются различия в соотношении заряда к массе, что затрудняет разделения. В этом случае метод КЭХ оказывается более предпочтительным.
Капиллярный гель-электрофорез Данная разновидность КЭ является аналогом традиционного зонного гель-электрофореза при сопутствующем разделении макромолекул по их размерам. Капилляр заполняют пористым полимерным гелем, что обусловливает молекулярно-ситовый эффект при продвижении через него молекул. Таким образом, разделение здесь основано как на электрофоретической подвижности, так и на различиях в размерах молекул, за счет чего достигается большая разрешающая способность метода.
Проводятся исследования по заполнению капилляра жидким гелевым наполнителем (гелевыми растворами, способными к прокачиванию, например, обработанной целлюлозой, растворенной в буфере). Это позволяет заменить гель в капилляре с целью устранения проблем загрязнения фиксированного геля матрицей анализируемого образца.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
