Г. Кристиан - Аналитическая химия, том 2 (1108738), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Уравнение (16.26) обычно справедливо для концентраций до нескольких миллионных долей (в зависимости от вещества). При более высоких концентрациях интенсивность флуоресценции с увеличением концентрации может снижаться. Причину можно объяснить следующим образом. В разбавленном растворе поглощаемое излучение равномерно распределяется по всей толщине раствора, а в растворе с высокой концентрацией большую часть излучения поглощает первый слой раствора на пути излучения.
Поэтому уравнение справедливо, когда основная часть излучения проходит сквозь раствор (более 92%). Оборудование для проведения флуоресцентного анализа Для измерения флуоресценции необходимо отделять испускаемое излучение от исходного. Проще всего это сделать, измеряя излучение флуоресценции под прямым углом к исходному излучению. Излучение флуоресценции испускается во всех направлениях, а исходное излучение проходит прямо сквозь раствор.
Схема простейшего флуориметра, для которого необходим источник УФ- излучения, показана на рис. 16.31. Большинство флуоресцирующих молекул поглощает УФ-излучение в широком интервале длин волн, поэтому простой источник линейчатого спектра годится во многих случаях. Таким источником служит ртутная лампа. В ней реализуется разряд в парах ртути при низком давлении, основные линии испускания: 2537, 3650, 5200 (зеленая), 5800 (желтая) и 7800 (красная) Л.
Излучение с длиной волны менее 3000 А опасно для глаз, поэтому на источник коротковолнового УФ-излучения смотреть нельзя. Пары ртути сами поглощают большую часть излучения с длиной волны 2537 Л, а чтобы отсечь видимый свет, используют синий фильтр. Таким образом, для активации молекул в основном применяется линия 3650 сь. В более сложных приборах, которые сканируют спектр (спектрофлуориметрах), используют ксеноновые лампы высокого давления (источник непрерывного спектра излучения).
Давление в лампе составляет 7 атм при 25 'С и 35 атм при рабочей температуре. (Необходима осторожность при работе!) В простом приборе (см. рис. 16.31) первичный фильтр (фильтр 1) служит для отделения излучения с длиной волны, близкой к излучению флуоресценции, потому что на практике часть излучения рассеивается. Первичный фильтр Известно, что е "= 1 — х + кз12! ... и что 1О "= е з*заз'. Таким образом, 1 — е з зез'ь' = 1 — [1 — 2,303аЬс ь т [2,303лЬс)з/2! ...1.
Квшзратичным членом и членами высших порядков можно пренебречь, если сЬс я 0,01, позтому разложение сводится к 2,303аЬс. Это ряд Тейлора. 16.15. ФЛУОРИМЕТРИЯ Фильтр 1 Рис. 16.31 Блок-схема простого флуориметра резец И УФ- Фильтр 2 ° Детектор 'т' пропускает только излучение с длиной волны возбуждения. Вторичный фильтр (фильтр 2) пропускает излучение флуоресценции, но не излучение возбуждения (которое может рассеиваться).
Иными словами, фильтр 1 не пропускает излучение, которое прошло бы через фильтр 2 и воспринималось бы как флуоресценция. Фильтр 2 не пропускает рассеянное излучение возбуждения и пропускает излучение флуоресценции. Так как обычное стекло пропускает значительную часть излучения с длиной волны 3550 Л, кюветы и фильтры изготавливают из стекла. Однако лучше использовать кварцевое стекло (существуют специальные нефлуоресцируюшие сорта). Такой простой прибор годится для многих целей.
Измерения флуоресценции (флуориметрические методы анализа) в 1000 раз чувствительнее по сравнению с измерениями оптической плотности (абсорбционная спектрометрия). Это легко понять, используя образное мышление. Например, измерение оптической плотности можно сравнить со взвешиванием корабля с капитаном и отдельно корабля, чтобы определить массу капитана 1Р= Р— Р), т. е. при анализе измеряется разность двух сигналов Ре н Р. Чувствительность определяется возможностью различить их; она зависит (среди прочих факторов) от стабильности работы прибора.
При флуоресцентном анализе мы «взвешиваем» только капитана; измеряется разность между нулем и некоторой конечной величиной, поэтому предел детектирования определяется интенсивностью источника, а также чувствительностью и стабильностью детектора («дробовые» шумы). Кроме того, в флуориметрии сигнал линейно зависит от концентрации в широком диапазоне, поэтому для флуориметрических методов анализа не только выше чувствительность, но и намного шире диапазон определяемых концентраций. В спектрофлуориметре измерение также проводят под прямым углом к исходному излучению. Однако вместо фильтров прибор включает два сканирующих монохроматора: один выделяет длину волны возбуждающего излучения, другой — флуоресценции.
В случае источника непрерывного спектра можно сканировать длину волны возбуждения и измерять флуоресценцию при разных ГЛАВА 16, МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ длинах волн. Интенсивность флуоресценции зависит от длины волны возбуждения (подобен спектру поглощения). Это позволяет определить длину волны максимального возбуждения флуоресценции.
Затем, установив длину волны возбуждения на это значение, можно сканировать по длинам волн излучение эмиссии, чтобы найти длину волны максимума флуоресценции. При сканировании этого спектра обычно наблюдается ложный пик, соответствующий длине волны возбуждающего излучения и вызванный рассеянием излучения. В спектрофлуориметрическом анализе трудно учесть изменения в интенсивности излучения источника или в чувствительности детектора при различных длинах волн, поэтому для конкретных условий эксперимента обычно строят градуировочные графики. При этом, поскольку интенсивность источника и чувствительность детектора могут изменяться день ото дня, прибор калибруют по стандартным растворам (измеряя их флуоресценцию и устанавливая соответствующее значение на шкале).
В качестве стандарта, как правило, используют разбавленный раствор хинина в разбавленной серной кислоте. Иногда требуется получить истинный спектр флуоресцирующего соединения для расчета квантовых выходов различных переходов. Для этого необходима поточечная корректировка изменений регистрируемого сигнала из-за изменений инструментальных параметров.
Для получения таких скорректированных спектров разработаны специальные приборы. При этом вносят поправки на нестабильность источника, облучая образец потоком света с постоянной энергией, и на колебания чувствительности детектора. Регистрируемый спектр представляют непосредственно в квантах испускаемого излучения на единичный интервал длин волн. 16.16. Оптические сенсоры: волоконная оптика В последние годы большой интерес вызывала разработка оптических сенсоров, действующих аналогично электрохимическим сенсорам (см. гл.
15). Это стало возможным после создания волоконно-оптических кабелей, передающих свет по гибкому кабелю (волноводу, световоду). Оптические волокна были сначала разработаны для систем связи, которые использовали передачу света на большие расстояния. Но они также оказались очень полезны и для передачи света к спектрометрам и создания сенсоров, селективных к определенному аналиту, посредством объединения волоконной оптики и химических реакций. При использовании оптических волокон нет необходимости помещать образец в спектрометр, так как свет может передаваться к образлу и возвращаться обратно по кабелям. Свойства оптических волокон Схематическое изображение волоконно-оптического кабеля показано на рис. 16.32.
Он состоит из действующей как волновод (световод) цилиндрической сердцевины, окруженной оболочкой с меньшим показателем преломления, и защитного слоя. Свет распространяется вдоль световода благодаря эффекту полного внут- 16Н 6. ОПТИЧЕСКИЕ СЕНСОРЫ: ВОЛОКОННАЯ ОПТИКА лг Оболочка Г..-' л...;,'. Серлцевина Защитнагй слой т ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ При подсоединении оптоволокна к спектрометру нужно выдержать баланс между желательным увеличением числовой апертуры (чтобы собрать больше света) и углом сбора самого спектрометра, значение которого обычно ограничено.
Это связано с тем, что свет, собранный с числовой апертурой, превышающей предел спектрометра, не будет «увиден» прибором. Обсуждение конструкционных проблем соединения волоконной оптики со спектрометром можно найти в книге [23!. Волоконная оптика может применяться при создании датчиков для традиционного спектрометрического и флуоресцентного анализа.
Для этого свет нужно передавать от источника излучения к образцу и обратно в спектрометр. Хотя существуют устройства, позволяющие пропускать и возвращать обратно свет по одному и тому же кабелю, обычно используют двухжильный (бифуркатный) кабель. Он состоит из двух волокон в одной оболочке, расщепленной на том конце, который идет к источнику излучения и спектрометру.
Часто кабели содержат несколько десятков тонких волокон, на одном конце половина из них случайным образом отделена от остальных. Для измерения поглощения маленькое зеркало присоединяют к кабелю на расстоянии нескольких миллиметров от его конца. Излучение от источника проникает через раствор образца и отражается обратно в волокно для сбора и передачи в спектрометр. Длина хода излучения равна удвоенному расстоянию между волокном и зеркалом.
Измерения флуоресценции проводят аналогичным способом, но без зеркала. Излучение, выходящее из конца волокна в форме конуса, возбуждает в растворе образца флуоресценцию, излучение которой собирается обратным кабелем и посылается в спектрометр. Часто для повышения интенсивности флуоресценции используют лазерные источники юлучения. 1,0 О,в о 0,6 л о 0,4 о Б й 0,2 0,0 495 526 557 588 619 650 Длина волны, нм РИС. 16.33.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
