Г. Кристиан - Аналитическая химия, том 2 (1108738), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Полагают, что возбужденная молекула переходит с колебательного уровня этого возбужденного электронного состояния на верхний колебательный уровень состояния бп который равен по энергии исходному возбужденному состоянию. Столкновение с молекулами растворителя в этот момент быстро удаляет избыток энергии и переводит молекулу с верхнего колебательного уровня на более низкий. Этот процесс назьвают колебательной релаксацией.
Указанные процессы потери энергии (внутренняя конверсия и колебательная релаксация) протекают очень быстро (-10 ы с), из-за чего непускание флуоресценции из более высоких состояний, чем 50 встречается редко. При достижении молекулой первого возбужденного синглетного состояния начинается внутренняя конверсия в основное состояние — процесс более медленный. Поэтому переход из первого возбужденного состояния путем испускания фотона — флуоресценция — может эффективно конкурировать с другими процессами потери энергии. Обычно после возбуждения флуоресценция происходит в течение 10 г — 10 э с. Следовательно, глаз не может воспринимать излучение флуоресценции после удаления источника возбуждения.
Поскольку флуоресценция происходит с нижнего возбужденного состояния, ее спектр (т. е. длина волны испускаемого излучения) не зависит от длины волны возбуждающего излучения. Однако интенсивность испускаемого излучения пропорциональна интенсивности исходного излучения (т. е. числу поглощенных фотонов).
Еще одна особенность рассматриваемых переходов состоит в том, что самому длинноволновому возбуждению соответствует самое коротковолновое непускание. Это полоса «0-0», отвечающая переходу между нулевыми колебательными уровнями состояний ба и Я~ (см. рис. 16.29). Пока молекула находится в возбужденном состоянии, у одного из электронов может измениться спин, и молекула перейдет в более низкое по энергии триплетное состояние посредством интеркомбинациониой конверсии. Благодаря процессам внутренней конверсии и колебательной релаксации молекула затем быстро достигает нижнего колебательного уровня первого возбужденного триплетного состояния (Т,). Отсюда молекула может вернуться в основное состояние Яа путем испускания фотона.
Это непускание называют фосфоресцеицией. 16.15. ФЛУОРИМЕТРИЯ РИС. 16.30 Спектр возбуждения и испускания флуоресцирующей молекулы 300 400 Донна волны, нм 500 Поскольку переходы между состояниями с разной мультиплетностью запрещены, время жизни состояния Т, намного превышает время жизни 01, и фосфоресценция — процесс более продолжительный, чем флуоресценция (>10 4 с). Этим объясняется часто наблюдаемое «послесвечение» фосфоресценции, длящееся после удаления источника возбуждения. Кроме того, из-за большого времени жизни безызлучательные процессы более эффективно конкурируют с фосфоресценцией, чем с флуоресценцией. По этой причине фосфоресценция обычно не наблюдается в растворах из-за столкновений с молекулами растворителя или кислорода. Для того, чтобы измерить фосфоресценцию образцы замораживают, охлаждая их до температуры жидкого азота ( — 196 'С), при этом столкновительные процессы сводятся к минимуму.
Твердые образцы также фосфоресцируют: многие неорганические минералы демонстрируют длительную фосфоресценцию. Проводились исследования, в которых молекулы из раствора адсорбнровались на твердую подложку, где они могли фосфоресцировать. Типичный спектр возбуждения и испускания флуоресцентной молекулы показан на рис. 16.30. Спектр возбуждения по форме обычно очень похож на спектр поглощения молекулы. Часто 1но не всегда) между структурами спектров возбуждения и испускания наблюдается близкое соответствие. У многих относительно крупных молекул расположение колебательных уровней в возбужденных состояниях (особенно о,) и в состоянии 5 очень похожи. Таким образом, форма спектра испускания, возникающего при переходах на различные колебательные уровни состояния оо, стремится походить на зеркальное отображение спектра возбуждения, отвечающего за переходы на различные колебательные уровни возбужденного состояния (например, 01).
Тонкая структура обусловлена также еще и различными вращательными уровнями на каждом колебательном уровне. Самое длинноволновое излучение в спектре поглощения и самое коротковолновое в спектре флуоресценции близки друг к другу по частоте и примерно ГЛАВА 1б. МЕГОЛЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СЛЕКТРОМЕГРИИ 72 соответствуют частоте перехода «О вЂ” 0» на рис. 16.29.
Некоторые различия между ними обусловлены различиями в теплотах сольватации молекул в возбужденном и невозбужденном состоянии. Флуоресцировать могут только те молекулы, которые поглощают излучение (обычно в УФ-области). Из поглощающих молекул флуоресцируют лишь -5 — 10'Ъ. Это хорошо с той точки зрения, что число мешающих определению веществ невелико. Испускаемое излучение может наблюдаться в УФ-области, особенно если соединение поглощает излучение с длинами волн менее 300 нм, однако более обычна флуоресценцня в видимой области. Именно испускаемое излучение измеряют и соотносят с концентрацией. Строение молекулы и флуореоценция В принципе любая молекула, которая поглощает УФ-излучение, может флуоресцнровать, однако по множеству причин этого часто не происходит.
Мы не будем углубляться в этот вопрос, а просто укажем, для каких веществ можно ожидать флуоресценцию. Прежде всего, чем сильнее поглощение, тем интенсивнее флуоресценция. Флуоресцируют многие ароматические и гетероциклические соединения, особенно если содержат определенные заместители. К флуоресценции склонны также соединения с сопряженными кратными связями.
Электронодонорные группы — ОН, — НН и — ОСН усиливают флуоресценцию. Флуоресцируют полициклические соединения типа витамина К, пуринов, нуклеозидов и сопряженные полиены типа витамина А. Группы — НОз, — СООН, — СН СООН, — Вг, — 1 и азогруппа подавляют флуоресценцию. Другие заместители могут изменять интенсивность флуоресценции. Флуоресценция многих молекул сильно зависит от рН, потому что только одна из форм (ионизированная или неионизированная) может оказаться способной флуоресцировать. Например, фенол СьНзОН флуоресцирует, а его аннан СьНзΠ— нет. Если соединение само не флуоресцирует, его можно превратить в производное, которое будет флуоресцировать. Например, нефлуоресцирующие стероиды можно превратить во флуоресцирующие соединения дегидратацией под действием концентрированной Н БО4.
Аналогично, двухосновные кислоты типа маленновой могут взаимодействовать с р-нафтолом в концентрированной серной кислоте с образованием флуоресцирующего производного. Уайт и Аргауэр разработали флуорнмегрнческнй метод определения многих металлов в виде хелатов с органическими соединениями (231. Антитела можно сделать флуоресцирующими реакцией конденсации с флуоресцеинизоцианатом, который взаимодействует со свободными аминогруппами белков. Флуоресцирует восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотида (ХАПН).
Это соединение участвует во многих ферментативных реакциях (см. гл, 24), и его флуоресценция служит основой для чувствительного метода количественного определения ферментов и их субстратов. Большинство аминокислот не флуоресцирует, но при взаимодействии с дансилхлоридом образуются флуоресцирующие производные.
16.16. ФЛУОРИМЕТРИЯ Тушение флуоресценции тз Соотношение между концентрацией и интенсивностью флуоресценции Из закона Бера легко вывести (см. задачу 48) уравнение, определяющее интен- сивность флуоресценции: (16.24) где ф — квантовый выход, т. е, постоянная, которая характеризует долю поглощенных фотонов, превратившихся в фотоны флуоресценции (таким образом, квантовый выход меньше или равен 1). Остальные члены уравнения те же, что в уравнении (16.10). Легко заметить, что интенсивность флуоресценции пропорциональна интенсивности источника, а оптическая плотность от Р не зависит. В таком случае, если произведение аЬс велико, член 10 ык становится пренебрежимо малым по сравнению с 1, и Г становится постоянной: Р= фР (16.25) Проблема, с которой часто встречаются при применении флуориметрии в количественном анализе, состоит в тушении флуоресценции многими веществами.
Эти вещества конкурируют за использование энергии электронного возбужденна и снижают квантовый выход (т. е. эффективность превращения поглощенного излучения в излучение флуоресценции, см. ниже). Чрезвычайно эффективный тушитель — иодид-ион. Атомы 1 и Вг в качестве заместителей снижают квантовый выход. Соединения такого типа можно определять косвенно, измеряя степень тушения флуоресценции. Некоторые молекулы не флуоресцируют, потому что содержат связи, энергия диссоциации которых меньше энергии излучения.
Иными словами, связь может рваться, предотвращая флуорееценцию. Присутствие окрашенных частиц, поглощающих излучение флуоресценции, в растворе с флуоресцирующими частицами также могут сказаться на анализе. Это проявление так называемого эффекта внутреннего фильтра. Например, в растворе карбоната натрия дихромат калия имеет максимумы поглощения при 245 и 348 нм. Они перекрываются с полосами возбуждения (275 нм) и флуоресценции (350 нм) триптофана и мешают его определению.
Подобный эффект может возникать и при слишком высокой концентрации флуоресцирующего вещества. Некоторые молекулы вновь поглощают излучение, испущенное соседними молекулами (см. ниже обсуждение вопроса о соотношении интенсивности флуоресценции и концентрации). ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ С другой стороны, если аЬс мало (< 0,01), с помощью разложения в ряд можно показать', что хорошим приближением служит выражение (16.26) Р = 2,303фРоаЬс Таким образом, для низких концентраций интенсивность флуоресценции прямо пропорциональна концентрации. Она также пропорциональна интенсивности возбуждающего излучения.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
