диссертация (1105558), страница 23

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 23)

4.4. Применение ОФА для хроматографического определения гидразинов

Диальдегиды являются перспективной группой реагентов для гидразинов, поскольку они селективны к гидразинам и не требуют нуклеофильного реагента, как в случае реакций с аминами и аминокислотами. Некоторые условия протекания таких реакций, описанные Коллинзом и соавт. [70], не требуют высоких температур и длительной пробоподготовки.

4.4.1. Дериватизация гидразинов с ОФА

Дериватизация первичной аминогруппы аминокислот, пептидов и аминов ортофталевым альдегидом хорошо известна и описана в научной литературе, в то время как возможность применения этого реагента для определения замещенных гидразинов практически не рассматривалась. Реакции ОФА с аминогруппой протекают при комнатной температуре в течение нескольких минут, однако известно, что образующиеся производные не очень стабильны.

Для выбора условий дериватизации изучили влияние рН среды на интенсивность флуоресценции о-фталевых производных гидразина, метилгидразина и несимметричного диметилгидразина. Как видно из рис. 49, 50, флуоресценция производных увеличивается с увеличением рН реакционной среды.

Рис. 49. Зависимость интенсивности флуоресценции ОФА-гидразинов от рН реакционной среды. λ_возб.=340 нм, λ_эм.= 450 нм, ширина щели 1,5 нм, l = 1 см.

Показано, что одновременно с гидразином, монометилгидразином и 1,1-диметилгидразином можно работать при рН 9,5, так как только при этих условиях интенсивность флуоресценции о-фталевых производных заметно выше, чем сигнал реагента. В целом, интенсивность флуоресценции ОФА-гидразинов возрастает с увеличением pH среды. Боратный буферный раствор выбран в качестве среды для протекания реакции как обладающий максимальной буферной емкостью в этой области рН. Условия детектирования ОФА производных гидразинов, полученные при снятии спектров возбуждения и флуоресценции в кювете с длиной оптического пути 1 см: λ_возб.=340 нм, λ_эм.= 450 нм (рис. 51-53).

Рис. 50. Зависимость интенсивности флуоресценции ОФА-производных от рН реакционной среды. λ_возб.=340 нм, λ_эм.= 450 нм и ширине щели 3 нм, l = 1 см.

4.4.2. Выбор условий хроматографического определения

При хроматографическом анализе растворов замещенных гидразинов после проведения дериватизации не было обнаружено сигнала на флуориметрическом детекторе. Отсутствие сигнала может быть связано с уменьшением интенсивности флуоресценции производных при элюировании их подвижными фазами с рН ниже 9.5, используемом для дериватизации. Как видно из рис. 51-53, при таком снижении рН интенсивность флуоресценции ортофталевых производных уменьшается. Так как нет полного замыкания 6-членного цикла, то флуоресцирующие формы ОФА-НДМГ и ОФА-ММГ производных находятся в кислотно-основном равновесии с неизлучающими формами. С другой стороны, уменьшение интенсивности можно объяснить разложением нестабильных производных в процессах сорбции-десорбции на колонке.

Для хроматографического определения использовали колонку, заполненную сорбентом на основе октадецилсиликагеля Zorbax SB-C18 размерами 4,6×150 мм. В качестве подвижных фаз использовали фосфатные буферные растворы с различным рН в диапазоне 2.0-7.0, ограниченном рабочей областью колонки. Для разделения и детектирования производных при более высоких рН 8-9 использовали колонку Synergi Fusion (4,6×150 мм), однако в этом случае не наблюдали флуоресценцию производных в хроматографической системе или увеличения аналитического сигнала.

Рис. 51. Спектр флуоресценции ОФА производного гидразина при изменении рН среды. λ_возб.=340 нм, λ_исп.= 450 нм, ширина щели 3 нм, l = 1 см.

Рис.52. Спектр флуоресценции ОФА производного ММГ при изменении рН среды. λ_возб.=340 нм, λ_исп.= 450 нм, ширина щели 3 нм, l= 1 см.

Рис. 53. Спектр флуоресценции ОФА производного НДМГ при изменении рН среды. λ_возб.=340 нм, λ_исп.= 450 нм, ширина щели 3 нм, l = 1 см.

Показано, что ОФА-НДМГ производное можно разделять и определять хроматографически, регистрируя сигнал на спектрофотометрическом детекторе при _погл.=340 нм. Оптимальные условия разделения достигаются при градиентном режиме элюирования фосфатным буферным раствором с рН 6.0 и ацетонитрилом. Хроматограмма раствора НДМГ приведена на рис. 54, основные хроматографические переметры разделения указаны в табл. 22.

ОФА-НДМГ

Рис. 54. Хроматограмма ОФА-НДМГ. (С_НДМГ =2 мг/л). Колонка Zorbax SB C18, 4.6x150 мм. Подвижная фаза: А – ацетонитрил / Б – 0,01 М фосфатный буферный раствор, рН 6.0, градиентное элюирование: 0 мин 15% А, 30 мин 85% А, 32-34 мин 15 %А. Скорость потока 1 мл/мин. Детектор – спектрофотометрический (_погл.=340 нм).

Таблица 22. Основные хроматографические параметры разделения ОФА производных гидразинов. Колонка Zorbax SB-C18 (4.6×150 мм)

В таблице 23 приведены метрологические характеристики определения НДМГ–ОФА. Такой подход не достаточно чувствителен, поэтому разработка последующей стадии концентрирования нецелесообразна. Таким образом, применение этого модификатора для хроматографического определения замещенных гидразинов не является перспективным.

Таблица 23. Метрологические характеристики хроматографического определения ОФА-НДМГ (n = 3, P = 0,95)

4.5. Применение НДА для сорбционно-хроматографического определения гидразинов

Нафталиндиальдегид позволяет осуществлять более чувствительное определение аминосоединений по сравнению с ОФА. Согласно работам [Колл], он образует флуоресцирующие производные с гидразином, метилгидразином и 1,1-диметилгидразином. В последнем случае из-за невозможности замыкания третьего шестичленного цикла в молекуле замещенного диазаантрацена интенсивность производного НДМГ на несколько порядков ниже, чем для остальных гидразинов.

В то время как большинство реагентов неселективны к гидразинам и взаимодействуют с большим количеством аминосоединений в составе матрицы пробы, взаимодействие НДА с гидразинами протекает по обоим карбонильным группам с образованием специфических производных – 2,3-диазаантраценов, при этом не требуется присутствие дополнительных нуклеофильных реагентов в реакционной смеси, как в случае дериватизации аминов и аминокислот. Реализация этого подхода в хроматографическом варианте определения и разделения может представлять селективный и очень чувствительный подход к определению гидразинов в природных водах.

4.5.1. Предколоночная дериватизация замещенных гидразинов с НДА

Дериватизацию замещенных гидразинов 2,3-нафталиндиальдегидом в растворе проводили в условиях, предложенных Коллинзом и соавт. [ ]. Значение рН 9.0 является оптимальным для образования диазаантраценов, поскольку обеспечивает максимальные скорости реакций и выход продуктов.

Для оптимизации процесса дериватизации необходимо установить время образования производного для каждого гидразина. Полученные зависимости (рис. 56) характеризуют необходимое время реакции – около 1 мин для образования Ги-НДА, 6 мин для ММГ-НДА и 10 мин для НДМГ-НДА. Таким образом, для дериватизации смеси гидразинов реакцию следует проводить в течение 10 мин при комнатной температуре в 0.1М боратном буферном растворе с рН 9.0.

Для получения воспроизводимых результатов и достижения низких пределов обнаружения важно получать устойчивые в условиях ВЭЖХ производные. Для изучения устойчивости НДА-гидразинов в реакционной среде раствор вводили в хроматограф через различные промежутки времени и измеряли площадь пика производного. Устновлено, что интенсивность аналитического сигнала Ги-НДА и ММГ-НДА не изменятся в пределах 24 ч, и производные стабильны при хранении в условиях окружающей среды. НДМГ-НДА стабилен в реакционной среде в течение рабочего дня, через сутки в растворе обнаруживали 50 % продукта от исходного. Таким образом, НДА-производные достаточно стабильны и не требуют особых условий хранения после проведения дериватизации.

Рис. 55. Реакции 2,3-нафталиндиальдегида с гидразином (а), монометилгидразином (б) и 1,1-диметилгидразином (в).

Рис. 56. Зависимость площади пика НДА-ММГ производного от времени реакции.

4.5.2. Выбор условий хроматографического определения

Для разработки подхода хроматографического определения НДА-гидразинов использовали колонки с сорбентами на основе обращенной фазы: Zorbax SB-C18, Zorbax Eclipse XDB-C8, Zorbax Eclipse AAA (4.6×150 мм, 5мкм, Agilent) и Gemini C18 (4.6×150 мм, 5мкм, Phenomenex). Состав подвижной фазы выбирали, используя различные смеси ацетонитрила, воды, фосфатных буферных растворов и фосфорной кислоты.

Ключевым параметром для хроматографического определения и детектирования НДА-гидразинов является рН подвижной фазы, так как оптимальные условия детектирования производного гидразина отличаются от таковых для его гомологов [ ]. Поведение НДА-гидразинов в хроматографической системе изучали в диапазоне рН 2.5 ‑ 9, согласно данным, изложенным Коллинзом и соавт.

Как упоминалось выше, рH 9 является оптимальным для дериватизации всех трех гидразинов. Согласно [ ], оптимальным рН для флуориметрического детектирования НДА-производного гидразина является 2.5-3.0, при котором образуется интенсивно флуоресцирующий кислотный конъюгат 2,3-диазаантрацена (V), т.е. структура VI (Рис. 55,a). Аналогичную зависимость мы наблюдали и в хроматографической системе. При элюировании подвижными фазами с нейтральной или щелочной средой сигнал флуоресценции Ги-НДА не регистрировался вследствие образования нефлуоресцирующего 2,3-диазаантрацена (V) (рис. 57). Параметры детектирования производного гидразина установлены в кювете с длиной оптического пути 1 см: λ_возб. = 395 нм, λ_эм. = 500 нм. В хроматографической системе максимум возбуждения флуоресценции наблюдали при 273 нм (рис. 58,а), вероятно, из-за влияния растворителей - компонентов подвижной фазы. Такие же параметры детектирования установлены и для ММГ-НДА, спектр возбуждения флуоресценции представлен на рис. 58,б.

Рис. 57. Зависимость площади пика НДА-производных гидразинов от рН подвижной фазы. 1 – ММГ-НДА, 2 – Ги-НДА, 3 – НДМГ-НДА.

При варьировании состава подвижной фазы обнаружено интересное поведение продукта реакции ММГ с НДА. Для производного монометилгидразина возможно флуориметрическое детектирование во всем изученном диапазоне рН. При нейтральном рН элюента наблюдали двойной либо несимметричный пик производного ММГ, что является свидетельством существования двух ионных форм деривата и влияния рН на структуру продукта. В кислой среде характер удерживания ММГ-НДА кардинально меняется, время удерживания производного мало для всех изученных неподвижных фаз и меньше, чем производного гидразина. Меньшее время удерживания ММГ-НДА по сравнению с Ги-НДА, а также установленная авторами [ ] протонированная в щелочной среде структура VIII (рис. 55,б) производного ММГ свидетельствуют о существовании в кислой среде с высокой концентрацией протонов структуры IX, протонированной по второму атому азота в молекуле замещенного диазаантрацена.

Производное ММГ в форме VIII возможно детектировать при высоких значениях рН (8-9), например, с содержанием в элюенте помимо органического растворителя 0.01 M Na₂HPO₄, pH 9. Существенным недостатком в этом случае является сильное взаимодействие ММГ-НДА со свободными силанольными группами сорбентов, что приводит к очень низкой эффективности системы из-за размывания хроматографического пика (рис. 59).

а

Характеристики

Список файлов диссертации