диссертация (1105558), страница 26

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 26)

а

Рис. 66. Спектры возбуждения (а) и флуоресценции (б) дансилхлорида и продуктов его реакции с замещенными гидразинами. l = 1 см, ширина щели 1,5 нм. рН 9.5.

Рис. 67. Спектр флуоресценции дансильного производного гидразина при изменении рН среды. λ_возб.=360 нм, λ_исп.=500 нм, ширина щели 1,5 нм, l = 1 см.

Рис. 68. Спектр флуоресценции дансильного производного ММГ при изменении рН среды. λ_возб.=360 нм, λ_исп.=500 нм, ширина щели 1,5 нм, l = 1 см.

Рис.69. Спектр флуоресценции дансильного производного гидразина при изменении рН среды. λ_возб.=360 нм, λ_исп.=500 нм.

Реакция дансилирования требует достаточно длительной пробоподготовки. Для увеличения выхода реакции установлена необходимость нагревания при 60 ºС в течение 1 часа. Результаты сравнивали с таковыми для реакции в темноте: такая пробоподготовка характерна для обеспечения наилучшего выхода производных при дансилировании аминосоединений. Также для ускорения реакции провели применяли СВЧ-излучение. Сравнение этих способов проиллюстрировано на рис. 70. Установлено, что максимальный выход продукта обеспечивается при нагревании при 60 ºС в течение 1 часа в щелочной среде (рН 9.5).

Рис. 70. Зависимость площади пика Днс-НДМГ от концентрации 1,1-диметилгидразина при нагревании и под действием СВЧ-излучения.

Как видно из рис. 70, выход производного НДМГ снижается примерно в два раза, и нарушается линейная зависимость в области высоких концентраций несимметричного диметилгидразина. Под действием СВЧ-излучения увеличивается скорость не только образования Днс-НДМГ производного, но и побочных реакций разложения и гидролиза реагента, что приводит к снижению чувствительности определения (табл. 32).

4.6.2. Выбор условий хроматографического определения

Для хроматографического определения использовали колонку с сорбентом на основе октадецилсиликагеля Zorbax SB-C18 размерами 4.6×150 мм. В качестве подвижных фаз использовали фосфатные буферные растворы. Максимальная чувствительность достигается при использовании в подвижной фазе фосфатного буферного раствора с рН 7.0 в градиентном режиме с ацетонитрилом.

При изучении поведения производного в хроматографической системе установлено, что регистрировать сигнал дансильного производного 1,1-диметилгидразина можно как с помощью флуориметрического (рис.71), так и спектрофотометрического (_погл. = 360 нм) детектора. Дансильные производные гидразина и монометилгидразина не зарегистрировали в хроматографичкской системе. Основные хроматографические параметры определения НДМГ приведены в таблице 31.

Днс-НДМГ

Днс-Cl

Рис. 71. Хроматограмма Днс-НДМГ .(С_НДМГ= 10 мг/л). Колонка Zorbax SB C18, 4.6х150 мм. Подвижная фаза: A - ацетонитрил / Б - Na₂HPO₄ 0,01 М (pH 7.0), градиентное элюирование: 0-5 мин 5% А, 15 мин 40% А, 20-25 мин 75% А, 27-34 мин 5% А. Скорость потока 1 мл/мин. Детектор – флуориметрический (l_возб.=360 нм, l_исп=500 нм). 1 – Днс-Cl, 2 – Днc-НДМГ.

Таблица 31. Основные хроматографические параметры разделения дансильного производного 1,1- диметилгидразина. Колонка Zorbax SB-C18 (4,6×150 мм)

Установлено, что чувствительность флуориметричесского детектирования Днс-НДМГ всего в несколько раз выше, чем спектрофотометрического: пределы обнаружения составили 0.05 и 0.2 мг/л соответственно, при объеме вводимой пробы 20 мкл. Метрологические характеристики ВЭЖХ определения производного НДМГ при двух способах пробоподготовки приведены в таблице 32.

Таблица 32. Метрологические характеристики хроматографического определения Днс-НДМГ производного (n = 3, P = 0,95)

Достигнутые пределы обнаружения НДМГ с дансил хлоридом достаточно высоки, и подход требует длительной пробоподготовки, поэтому такой реагент не является перспективным для дальнейшей работы.

4.7. Использование флуорогенного модификатора БФЗ для хроматографического определения ММГ и НДМГ

4.7.1. Выбор условий проведения дериватизации

Согласно существующим данным, взаимодействие 4-хлор-7-нитробензофуразана с аминогруппой протекает при нагревании (60-80 ºС) в течение 20-40 минут, в нейтральной или щелочной среде [74]. Реакция протекает через промежуточное образование малоустойчивого комплекса Мейзенгеймера [72], по механизму присоединения-элиминирования. На второй стадии интермедиат должен потерять не только уходящую группу, но и протон, откуда следует возможность катализа реакции основаниями. Согласно [72], выход реакции возрастает при увеличении рН, температуры и содержания органического растворителя в реакционной смеси. Поскольку взаимодействие НДМГ с аналогичным реагентом 4-хлор-5,7-динитробензофуразаном дает наибольший выход продукта при рН 7 в реакционной смеси [87], то выбор оптимальной температуры и времени реакции для НДМГ с БФЗ проводили при рН 7. Результаты, представленные на рис. 72, свидетельствуют о необходимости продолжительного нагрева реакционной смеси для получения производного НДМГ. Максимальный выход продукта обеспечивается нагреванием при 100°С в течение 2 часов.

Рис. 72. График зависимости интенсивности поглощения производного НДМГ от времени нагрева НДМГ с БФЗ при температуре 60°С, 80°С, 100°С. λ_погл.= 450 нм.

Изучение спектральных характеристик полученного производного показало, что максимум поглощения БФЗ-НДМГ лежит в диапазоне 450-470 нм, а максимум поглощения реагента соответствует 340 нм. На рис. 73 представлен спектр поглощения БФЗ-НДМГ, снятый в кювете с длиной оптического пути 1 см относительно холостого раствора.

Рис. 73. Спектр поглощения производного НДМГ-БФЗ в среде фосфатного буферного раствора (рН 7.0). l = 1 см.

Спектр поглощения производного НДМГ, снятый в потоке, имеет несколько смещенный максимум при 488 нм, что, вероятно, связано с влиянием органического растворителя в составе подвижной фазы.

Известно, что 4-гидразин-7-нитробензофуразан, использующийся для определения альдегидов и кетонов, является флуорогеном, а значит, не обладает собственной флуоресценцией, в то время как БФЗ-производные метиламина и диметиламина интенсивно флуоресцируют [73]. Из литературных данных [72] известно, что БФЗ поглощает при 338 нм, а продукты реакции с аминами флуоресцируют при 520-540 нм при λ_возб.= 450-470 нм.

Поскольку длительное нагревание реакционной смеси ведет к образованию побочных продуктов, включая продукт гидролиза самого БФЗ, изучение спектров флуоресценции НДМГ-БФЗ спектрофлуориметрическим методом затруднено. В данном случае необходимо снятие спектров в потоке после разделения компонентов смеси. Достоверность идентификации искомого производного НДМГ с БФЗ установили методом ВЭЖХ-МС в режиме химической ионизации, подтвердив структуру продукта реакции. Пик с m/z 222 отвечает производному НДМГ, с m/z 180 – продукту гидролиза БФЗ, с m/z 195 – осколочному иону согласно [73]. Соответствующая хроматограмма приведена на рис. 74.

БФЗ-НДМГ

БФЗ-ОН

Рис. 74. Хроматограмма НДМГ-БФЗ (С_НДМГ = 50 мг/л). Колонка Zorbax SB-C18, 4.6 × 150 мм. Элюент: 50% 0.1M ацетата аммония, 50% ацетонитрила. Скорость потока 0.7 мл/мин. Масс-спектрометрический детектор.

Установив время удерживания НДМГ-БФЗ, в этих рабочих условиях в хроматографической системе получили спектр флуоресценции продукта, зарегистрировав соответствующий производному пик на флуоресцентном детекторе. Как видно из спектра (рис. 75), максимум возбуждения флуоресценции НДМГ-БФЗ соответствует 488 нм, максимум эмиссии флуоресценции — 540 нм.

^нм

Рис. 75. Спектр возбуждения и эмиссии флуоресценции НДМГ-БФЗ. Колонка Zorbax SB-C18, 4.6 × 150 мм. Элюент: 50% 0.1M ацетата аммония, 50% ацетонитрила. Скорость потока 0.7 мл/мин.

Одним из основных факторов, влияющих на выход продукта данной реакции, является рН реакционной смеси, который также оказывает существенное влияние на интенсивность флуоресценции. Влияние рН на площадь хроматографического пика БФЗ-НДМГ изучали с использованием аммонийно-ацетатных и фосфатных буферных растворов (рН 3.6–8.0). Как видно из рис. 76, максимальная интенсивность флуоресценции наблюдается при рН 7.0, что соответствует оптимальному рН образования продукта согласно данным спектрофотометрического детектора и согласуется с теоретическими представлениями. Элюирование проводили в изократическом режиме подвижной фазой, содержащей 50% 0.05М фосфатного буферного раствора (рН 4.0) и 50% ацетонитрила со скоростью 0.7 мл/мин.

Рис.76. График зависимости площади хроматографического пика производного НДМГ от рН буферного раствора для проведения реакции. Колонка Zorbax SB-C18, 4.6 × 150 мм. Элюент: 50% 0.05М NaН₂PO₄(рН 4.0)/50% ACN. Скорость потока 0.7 мл/мин. Флуориметрический детектор.

Для протекания этой реакции не требуется большого избытка дериватизующего реагента, достаточно присутствия 20-кратного избытка замещенного бензофуразана по отношению к НДМГ.

Полученный продукт реакции устойчив в растворе при комнатной температуре в течение 48 часов. Через 3 дня в растворе обнаруживали 80% НДМГ-БФЗ от исходного.

В целом, оптимальный состав реакционной смеси для достижения наибольшего выхода НДМГ-БФЗ совпадает с таковым для реакции диметилгидразина с дБФЗ, различие заключается в необходимости длительного высокотемпературного нагрева.

В этих реакционных условиях для монометилгидразина получено его бис-производное с 4-хлор-7-нитробензофуразаном, имеющее максимум поглощения при 553 нм, не обладающее флуоресценцией. Структура деривата установлена методом ВЭЖХ-МС с химической ионизацией в режиме сканирования отрицательных ионов, на хроматограмме (рис.77) производному МГ-БФЗ соответствует пик с m/z = 371.

Характеристики

Список файлов диссертации