диссертация (1105558), страница 20

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 20)

Рис. 20. Спектры поглощения диметилгидразона коричного альдегида в зависимости от рН. l = 1 см.

Полученные зависимости свидетельствуют о том, что в кислой среде большая часть гидразона переходит в протонированную форму с большей интенсивностью поглощения, максимум поглощения которой соответствует 330 нм.

Установлено, что производное НДМГ можно разделять и определять хроматографически на колонке Nucleosil 5-C18 с октадецилсиликагелем, регистрируя сигнал на спектрофотометрическом детекторе. Наблюдение изменения площади хроматографического пика гидразона в зависимости от длины волны детектирования показало, что максимум поглощения гидразона хорошо выражен и находится при 300 нм (рис. 21). Полученные данные подтверждают, что при элюировании подвижной фазой с рН 2.3 в хроматографической системе регистрируется протонированная форма диметилгидразона, обладающая большей интенсивностью поглощения по сравнению с нейтральной формой. Небольшой сдвиг максимума поглощения диметилгидразона в хроматографической системе в коротковолновую область по сравнению со спектрофотометрическими измерениями может быть вызван влиянием ацетонитрила, содержащегося в подвижной фазе.

Рис. 21. Зависимость площади хроматографического пика диметилгидразона коричного альдегида от длины волны поглощения. Колонка Nucleosil 5-C18, 4.6 × 150 мм. Элюент: 60% 0.05М Н₃PO₄/40% ACN. Скорость потока 1 мл/мин.

Получение гидразонов подразумевает использование большого избытка реагента, так как скорость реакции и выход продукта увеличиваются в этом случае. В работе было изучено влияние избытка реагента на полноту протекания реакции дериватизации НДМГ коричным альдегидом. Как видно из рис. 22, выход гидразона возрастает с увеличением избытка регента до соотношения 1:1000 и далее остается постоянным. Таким образом, достаточным является 1000-кратный избыток реагента.

Рис. 22. График зависимости площади хроматографического пика производного НДМГ от величины избытка коричного альдегида.

Смещению равновесия в сторону образования гидразона способствует также нагревание реакционной смеси. Из литературных данных известно, что оптимальным интервалом температур проведения реакции дериватизации НДМГ коричным альдегидом является 80–100ºС. Поэтому мы проанализировали влияние времени нагрева реакционной смеси при 95ºС. Как следует из рис. 23, максимальный выход продукта реакции достигается при нагревании реакционной смеси в течение 15 мин. Дальнейшее нагревание приводит к уменьшению выхода продукта реакции, что может быть связано с разрушением диметилгидразона при длительном воздействии высокой температуры. Полученный продукт реакции устойчив при комнатной температуре в течение 48 часов. Через 3 дня в растворе обнаруживали 73.5% гидразона от исходного.

Рис. 23. График зависимости площади хроматографического пика производного НДМГ от времени нагрева НДМГ с коричным альдегидом.

Таким образом, в качестве оптимальных условий проведения реакции дериватизации НДМГ коричным альдегидом выбраны следующие:

– 0.05М аммонийно-ацетатный буферный раствор с рН 5.4;

– 50% ацетонитрила;

– 1000-кратный избыток реагента;

– нагревание реакционной смеси при 95ºС в течение 15 минут.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что максимальная интенсивность флуоресценции диметилгидразона коричного альдегида наблюдается при выбранных нами оптимальных условиях получения производного.

Структура продукта реакции НДМГ с коричным альдегидом подтверждена с помощью метода ВЭЖХ-МС в режиме химической ионизации. Пик с m/z 174.85 и 215.9, отвечает диметилгидразону коричного альдегида и его ассоциату с ацетонитрилом соответственно. Хроматограмма приведена на рис. 24.

m/z 161.9

m/z 202.85

m/z 173.8

m/z 199.95

m/z 201.85

m/z 215.9

m/z 174.85

Рис. 24. Хроматограмма диметилгидразона коричного альдегида (С_НДМГ = 50 мг/л). Колонка Nucleosil 5-C18, 4.6 × 150 мм. Элюент: 55% 0.05M CH₃COOH/45% ACN. Скорость потока 0.7 мл/мин. Масс-спектрометрический детектор.

4.2.2. Оптимизация условий хроматографического определения

Основными факторами, определяющими удерживание в методе ОФ ВЭЖХ, являются полярность неподвижной фазы и содержание органического растворителя в элюенте. Колонка Nucleosil 5-C18 с октадецилсиликагелем показала хорошие результаты при разделении производного, поэтому другие фазы не рассматривали. В качестве органической добавки в подвижную фазу использовали ацетонитрил. Ацетонитрил имеет очень малую фоновую оптическую плотность даже при столь малой длине волны, как 200 нм. Эти почти идеальные спектральные свойства в сочетании с превосходной растворяющей способностью и уникальными хроматографическими свойствами обусловливают широкое использование ацетонитрила для разделения варианте ОФ ВЭЖХ. Установлено, что для оптимального разделения производного НДМГ подвижная фаза должна содержать 40% ацетонитрила.

При выборе условий хроматографического определения производного НДМГ большое значение имеет рН подвижной фазы, так как от этого зависит форма существования и устойчивость деривата в хроматографической системе. Соответствующие значения рН в диапазоне 2.3–7.2 создавали использованием растворов фосфорной кислоты (рН 2.3), уксусной кислоты (рН 3.4), фосфатных буферных растворов (рН 4–7.2). Варьирование рН в данном диапазоне обусловлено ограниченной рабочей областью колонки (рН 2–8). На рис. 25 представлен спектр поглощения диметилгидразона коричного альдегида, снятый в потоке, в зависимости от рН подвижной фазы. При использовании в элюенте 0.05М фосфорной кислоты (рН 2.3) диметилгидразон коричного альдегида имеет максимум поглощения при 300 нм, что соответсвует протонированной форме гидразона. При увеличении рН до 4.0 происходит сдвиг максимума поглощения в длинноволновую область, соответствующую поглощению нейтральной формы гидразона, с уменьшением интенсивности сигнала.

Рис. 25. Спектры поглощения диметилгидразона коричного альдегида. Колонка Nucleosil 5-C18. Скорость потока 1 мл/мин.

В диапазоне рН 4.0–7.2 регистрируется непротонированная форма гидразона с λ_макс = 400 нм, при этом значительно возрастает время удерживания диметилгидразона (с 5.5 до 20 мин), что связано с сильным взаимодействием непротонированной гидрофобной формы гидразона с поверхностью сорбента (табл. 14). Как следствие, происходит уширение хроматографического пика гидразона, и значительно снижается эффективность хроматографической системы. В качестве оптимальной подвижной фазы выбрали 0.05М фосфорную кислоту (рН 2.6) с 40% содержанием ацетонитрила, обеспечивающую наибольшую эффективность системы и приемлемое время удерживания диметилгидразона (табл. 14).

Таблица 14. Основные хроматографические параметры удерживания диметилгидразона коричного альдегида (С_НДМГ = 20 мг/л) в зависимости от состава подвижной фазы. Спектрофотометрический детектор, _макс = 300 нм

^* - R_s везде рассчитывали как разрешение с соседним пиком.

Изучение влияния рН элюента на положение максимумов возбуждения и эмиссии флуоресценции показало аналогичные зависимости для флуориметрического детектирования: максимум возбуждения флуоресценции сдвинут в коротковолновую область по сравнению с нейтральной формой гидразона, максимум эмиссии при этом остается без изменений (рис. 26).

Рис. 26. Спектры возбуждения и эмиссии флуоресценции при различных значениях рН подвижной фазы. Колонка Nucleosil 5-C18. Скорость потока 1 мл/мин. Детектор — флуориметрический (l_возб = 328 нм, l_эм = 396 нм).

В таблице 15 представлены основные хроматографические параметры удерживания диметилгидразона коричного альдегида в зависимости от состава подвижной фазы. Видно, что, как и в случае использования спектрофотометрического детектирования, с увеличением рН существенно увеличивается время выхода диметилгидразона, что свидетельствует о его депротонировании и сильном взаимодействии нейтральной гидрофобной формы гидразона с сорбентом. Но так как площади пика диметилгидразона практически не меняются при переходе гидразона из протонированной в непротонированную форму, то можно сделать вывод, что обе формы существования гидразона являются флуоресцирующими. В качестве оптимальной подвижной фазы выбрали 0.05М уксусную кислоту (рН 3.4), как обеспечивающую наибольшую эффективность системы, приемлемое время удерживания диметилгидразона и разрешение с соседними пиками компонентов реакционной смеси. (табл. 15).

Таблица 15. Основные хроматографические параметры удерживания диметилгидразона коричного альдегида (С_НДМГ = 20 мг/л) в зависимости от состава подвижной фазы. Спектрофотометрический детектор, _макс = 300 нм

В процессе выбора условий хроматографического разделения производных было использовано несколько программ градиентного элюирования. Установлено, что наилучшее разделение диметилгидразона коричного альдегида с флуориметрическим детектированием достигается, если на начальном этапе (0–30 мин) подвижная фаза содержит 45% ацетонитрила, с последующим (30–34 мин) увеличением содержания органического модификатора до 90%.

Оптимальные условия хроматографического определения диметилгидразона отличаются для вариантов спектрофотометрического и флуориметрического детектирования из-за различий в удерживании детектируемых при выбранных условиях посторонних компонентов пробы. Соответствующие хроматограммы для двух типов детектирования приведены на рис. 27 и 28.

НДМГ

Время, мин

Рис. 27. Хроматограмма диметилгидразона коричного альдегида (С_НДМГ = 0.1 мг/л). Колонка Nucleosil 5-C18, 4.6 × 150 мм. Элюент: 60% 0.05М Н₃PO₄/40% ACN. Скорость потока 1 мл/мин. Спектрофотометрический детектор, λ_макс = 300 нм.

НДМГ

Характеристики

Список файлов диссертации