Диссертация (1105151), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Мощность инфракрасныхлазеров в образце была 20 мВт для каждой из ловушек, что достаточно для эффективного захвата, но в тоже время не оказывает существенного воздействия оптическойловушки на эритроцит, связанного с нагревом клетки [121]. Затем с помощью акустооптического дефлектора положение первой ловушки приводилось в периодическоедвижение вдоль линии, соединяющей центры ловушек. Положение же второй ловушки оставалось постоянным.
Смещение первой ловушки во времени было осуществленопо гармоническому закону с амплитудой 100 нм и частотой в диапазоне от 50 Гц до1 кГц. Это вызывало осцилляции клетки и, в частности, смещение ее краев. Лазеры сдлинами волн излучения в вакууме 670 и 635 нм были сфокусированы на края клеток,а рассеянное излучение собиралось на чувствительную поверхность квадрантных фотодиодов. Чтобы минимизировать влияние на оптический захват, мощность лазеровсистемы детектирования малых смещений была менее 0,2 мВт. Одной из основныхпроблем при определении смещений этих краев является то, что в отличие, например, от сферических и изотропных микрочастиц полистирола картина рассеянногоизлучения от клетки не является симметричной.
Это затрудняет прямое измерениеабсолютных смещений. Но с другой стороны в эксперименте оказалось, что края эритроцита создают контрастные изображения на соответствующих квадрантных фото-Применение оптического пинцета для определения силовых...96диодах, что дает возможность с хорошей точностью определять фазу их движенияотносительно периодического смещения положения ловушки.Время измерения для каждой частоты осцилляций первой ловушки было T . Тогда,используя преобразование Фурье, сигнал с каждого квадрантного фотодиода можнопредставить как:∞A0 Xf(t) =(Ak cos kω0 t + Bk sin kω0 t) =+2k=1∞A0 XCk sin(kω0 t − ϕk ),+=2k=1гдеZ2 TAk =f(t) cos kω0 tdt,T Z02 Tf(t) sin kω0 tdt,Bk =T 0qAkCk = A2k + Bk2 , ϕk = − arctg,Bk(91)(92)(93)и ω0 = 2π/T .
При периодическом механическом воздействии с частотой ω = nω0величина ϕn характеризует сдвиг фазы в смещении краев эритроцита относительноэтого воздействия. Таким образом, измеряя в эксперименте временную зависимостьсмещений краев эритроцита f(t)1,2 , можно получить величину относительной фазыколебаний противоположных краев эритроцита ϕ = ϕn2 − ϕn1 с помощью стандартного алгоритма численного преобразования Фурье. Здесь и далее индексы “1” и “2”относятся к краям эритроцита в осциллирующей и неподвижной ловушке, соответственно.Относительная фаза колебаний краев эритроцита ϕ была измерена как функциячастоты колебаний ловушки ω. На рисунке 35 показаны типичные зависимости тангенса этой фазы.
Полное измерение занимает 20 с и для контроля воспроизводимостипроводится в два направления — при возрастании частоты, и при ее уменьшении.Так как эти зависимости оказались идентичными, то изменениями во времени пренебрегли и результаты для измерений в обоих направлениях были усреднены.
Экспериментальные результаты показывают, что тангенс относительной фазы колебанийкраев эритроцита пропорционален частоте осцилляций ловушки в диапазоне от 50 Гцдо 1 кГц. При этом коэффициент пропорциональности зависит от состояния мембра-97Применение оптического пинцета для определения силовых...ны эритроцита. В частности, для обычных эритроцитов в плазме крови, которымна графике (рисунок 35) соответствуют незакрашенные точки, этот наклон равен(−6, 4 ± 0, 1) · 10−4 с.
Закрашенные же точки соответствуют клеткам, предварительнофиксированным путем добавления в образец 2,5% глутарового альдегида, которыйувеличивает жесткость клетки, связывая трансмембранные белки мембраны. Наклонкривой для зафиксированных эритроцитов оказался равным (−2, 7 ± 0, 2) · 10−4 с.Для объяснения зависимости, представленной на рисунке 35, удобно рассмотретьфеноменологическую механическую модель эритроцита, отраженную на рисунке 34б.Жесткости оптических ловушек k и эритроцита K представлены пружинами.
Поршнями в модели отражены эффективные коэффициенты вязкого трения γ и Γ модельной системы локализованного в две ловушки эритроцита. Тогда уравнение движениядля края эритроцита находящегося в неподвижной (второй) ловушке:mẍ2 = −γ ẋ2 − k(x2 − xtrap) + Γ(ẋ1 − ẋ2 ) − K(x2 − x1 − L),2(94)где L — длина недеформированной K-пружины, соответствует размеру эритроцита, xtrap— положение неподвижной (второй) ловушки, x1 и x2 — положения краев2эритроцита, соответственно, в неподвижной и подвижной ловушках, m отвечает заэффективную массу. Как было показано на примере микрочастиц в начале главы,массой в системах с характерным размером единиц микрометров можно пренебречь.Действительно, средняя масса эритроцита около 10−13 кг, и для частот колебаний до1 кГц должно выполняться условие mω 2 ≪ k + K.Измеряемыми в эксперименте переменными являются смещения противоположных краев эритроцитов ∆x1 и ∆x2 из точек их равновесия. Тогда уравнение движения:(γ + Γ)∆ẋ2 = Γ∆ẋ1 − (k + K)∆x2 + K∆x1 .(95)Пусть движение краев эритроцита из точек равновесия описывается следующимизаконами движения ∆x1 = x̃1 eiωt , ∆x2 = x̃2 eiωt .
Подставляя эти решения в уравнение(95), получаем:(k + K + iω(γ + Γ)) x̃2 = (K + iωΓ)x̃1 .(96)В предположении, что частоты рассматриваемого диапазона удовлетворяют условиюПрименение оптического пинцета для определения силовых...98Рис. 34: a) Одиночный эритроцит, находящийся в двух независимых оптических ловушках;б) Феноменологическая механическая модель эритроцита в двух оптических ловушках, k —эффективная жесткость оптических ловушек, K — коэффициент эластичности эритроцита,γ и Γ — эффективные коэффициенты вязкости системы.Рис. 35: Зависимость тангенса фазы колебаний края эритроцита в неподвижной ловушке относительно края в осциллирующей ловушке от частоты осцилляций.
Не закрашенныеточки соответствуют нормальным эритроцитам, а закрашенные относятся к эритроцитам,фиксированным глутаровым альдегидом. Сплошные линии — линейные аппроксимации соответствующих зависимостей.Применение оптического пинцета для определения силовых...99ω 2 ≪ k(k + K)/Γ(Γ + γ), получаем выражение для тангенса разности фаз колебанийкраев эритроцита:tan ϕ = −Γk − γKω = −ωτ.k(k + K)(97)Коэффициент пропорциональности τ определяет вязко-упругие характеристикизахваченной в оптическом пинцете биологической клетки, как сложной гидродинамической системы. Коэффициент τ имеет размерность времени, поэтому его можнорассматривать как некое время отклика, связанное с характерным временем распространения механического возмущения в клетке.
Экспериментальные данные показывают, что для фиксированного глутаровым альдегидом эритроцита это время сокращается с 640 до 270 мкс, указывая на существенные изменения состояния клетки.Таким образом, величина τ может быть использована для контроля эффективнойжесткости клетки.Длина волны используемых лазеров лежит в так называемом “окне прозрачности”для большинства биологических структур, при этом наименьшее поглощение оптического излучения наблюдается как раз вблизи 970 нм, что соответствует используемым в установке лазерам, формирующим ловушки, с излучением на длине волны975 нм. Но из-за фокусировки интенсивность лазерного излучения в каждой оптической ловушке достигает величин порядка единиц МВт/см2 , поэтому необходимо бытьуверенным в отсутствии фотоиндуцированных изменений исследуемой клетки в ходе измерения, то есть в том, что предлагаемый метод контроля жесткости клеткисам по себе является неинвазивным.
Для проверки данного факта был проведен дополнительный эксперимент. Одиночный эритроцит, как и прежде, был “захвачен” закрая в две оптические ловушки. При этом положение первой ловушки осциллировалос частотой 1 кГц и амплитудой 100 нм. Разность фазы колебаний противоположныхкраев эритроцита измерялась как функция времени. Полученная зависимость показана на рисунке 36. Как видно из графика, на временах до 160 с разность фаз остаетсяпостоянной, что говорит об отсутствии существенных изменений в форме или вязкоупругих характеристиках эритроцита в ходе эксперимента. Тем более, что получениеполной частотной зависимости разности фаз от 50 Гц до 1 кГц занимает не более 20 с.Применение оптического пинцета для определения силовых...1003.
Определение силы для дезагрегации эритроцитовИмея данные приведенной выше калибровки силы захвата края эритроцита в оптической ловушке, можно перейти непосредственно к изучению силы взаимодействияэритроцитов между собой. Как было показано в параграфе 3.5.4 обзора литературы,эритроциты подвержены агрегации, то есть эритроциты склонны “прилипать” друг кдругу образуя структуры типа “монетных столбиков”. Aгрегация/дезагрегация эритроцитов влияет на микроциркуляцию крови на уровне микрососудов. В норме и принекотрых патологиях характеристики процессов агрегации/дезагрегации различаются, что приводит к ухудшению снабжения тканей кислородом.3.1.
Подготовка исследуемого образцаСпособ забора и подготовки крови к исследованиям силового взаимодействия взаимодействия эритроцитов отличался от приведенного выше. Это связано с одновременной отработкой возможного медицинского применения технологии оптическогопинцета для диагностики патологий, описанного в работах [6, 122] на примере аутоиммунного заболевания — системной красной волчанки. Поэтому кровь получалисогласно нормам забора крови для анализов в Клинике нефрологии, внутренних ипрофессиональных болезней имени Е.М.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
