Диссертация (1105151), страница 16
Текст из файла (страница 16)
При этом плоскость эритроцитароного диска содержит ось распространения лазерного излучения, то есть эритроциты в ловушке всегда ориентируются вдоль направления излучения. На рисунке 31априведены микрофотографии отражающие динамику захвата эритроцита. Эти фотографии сделаны с промежутком в 0,2 секунды. Видно, что эритроцит ориентируетсявдоль направления излучения за время менее 1 с.
В оптической ловушке эритроцитпрактически не изменяет свою форму, что указывает на неразрушающий характердействия лазерного излучения ловушки на исследуемую клетку.2.3. Калибровка силы оптического захвата эритроцитаДля определения каких-либо количественных параметров необходимо знать силу захвата эритроцита в оптическую ловушку. Для этого был проведен следующий эксперимент. Изначально был изготовлен изотонический (имеющий осмотическое давление, равное внутриклеточному) натрий-фосфатный буферный раствор со следующими концентрациями солей: 10 мМ гидрофосфата натрия, 1,76 мМ дигидрофосфатакалия, 2,7 мМ хлорида калия и 137 мМ хлорида натрия. Осмотическая концентрацияраствора 0,3 осмоль/л, кислотность pH=7,4, и калий-натриевый баланс соответствуют плазме крови.
То есть эритроциты, погружëнные в такой раствор, должны находится в равновесном состоянии — молекулы воды диффундируют через клеточнуюмембрану в равном количестве внутрь и наружу, не накапливаясь и не теряясь клеткой. Отклонение осмотического давления от нормального физиологического уровняможет нарушить структуру и целостность клеточных мембран.
Полистироловые микрочастицы диаметром 3 мкм (PPs-3.0COOH, G.Kisker GmbH, Германия) промывалисьцентрифугированием в приготовленном растворе три раза по 5 минут со скоростьювращения ротора 3000 об./мин. Затем небольшое количество данных частиц добавлялось в образец, так чтобы концентрация эритроцитов и частиц совпадала. Частицыбыли изначально функционализированны карбоксильными группами, которые могутхимически связываться с некоторыми белками на мембране эритроцита. Затем в одну ловушку оптического пинцета из взвеси захватывали эритроцит на расстоянии10 мкм от поверхности, а в другую — частицу.
Меняя расстояния между оптическимиловушками, эритроцит и частицу соединяли вместе. Через 1–2 минуты частица необратимо приклеивалась к эритроциту. Микрофотография образованного комплексаПрименение оптического пинцета для определения силовых...91показана на рисунке 32б. Мощность ловушки, в которой находился край эритроцита, была 20 мВт, а мощность ловушки, в которой находилась частица, подбирали так,чтобы при увеличения расстояния между ловушками вероятность комплекса остатьсяв каждой из ловушек была одинаковой.
То есть уравновешивали максимальную силу, развиваемую ловушками с краем эритроцита и с полистироловой микрочастицей.Для пяти исследованных комплексов силы оказались уравновешены при мощностилазерного излучения 17 ± 1 мВт в ловушке с микрочастицей. Максимальная сила захвата микрочастицы в свою очередь определялась по силе вязкого трения в средес известным коэффициентом динамической вязкости.
Согласно экспериментальнымданным полученным с помощью рефрактометра Аббе ИРФ-21, показатели преломления n = 1.351 и дисперсии для 15% водного раствора глицерина равны показателямдля использованной плазмы, и ожидалось, что сила, развиваемая оптическим пинцетом, будет для обоих сред одинакова. Поэтому в кювету помещалась суспензия такихже микрочастиц в растворе глицерина, и выполнялся оптический захват одной изчастиц на высоте 10 мкм над поверхностью стекла (см. рисунок 32в). Затем оборудованный электродвигателями предметный столик с образцом приводился в движениесо скоростью v. При этом на частицу начинала действовать сила вязкого тренияFvisc = γ · v, где γ — коэффициент вязкого трения для сферической частицы радиусаa, центр которой находится на расстоянии h от поверхности. По уточненной формулеСтокса, учитывающей влияние поверхности кюветы [2, 116–119]:γ=6πηa .a 39 a+O1−16 hh(89)Согласно литературным данным [120] коэффициент динамической вязкости при температуре 25◦ C для раствора глицерина составляет η = 1, 32 ± 0, 02 мПа·c.
При увеличении скорости движения столика сила вязкого трения, действующая на частицу,увеличивалась до тех пор, пока частица не выпадала из ловушки. Таким образом, дляловушки с мощностью лазерного излучения внутри образца 17 мВт была определена максимальная развиваемая ловушкой сила, которая составила 29 ± 2 пН. Данныйподход для определения силы захвата был применим, так как движение частицы вжидкости было ламинарным, число Рейнольдса порядка 10−3 (плотность раствораПрименение оптического пинцета для определения силовых...92Рис.
31: Микрофотографии эритроцитов в установке оптического пинцета. а) Динамиказахвата эритроцита в оптическую ловушку. Микрофотографии сняты в интервалом в 0,2 с.б) Искусственно собранный агрегат эритроцитов.Рис. 32: Определение максимальной силы удержания края эритроцита оптической ловушкой. а) Сравнение силы захвата края эритроцита с силой захвата сферической микрочастицы.
б) Микрофотография образованного комплекса эритроцита с полистироловой микрочастицей. в) Калибровка силы захвата сферической микрочастицы Ftrap по силе вязкоготрения Fvisc .Применение оптического пинцета для определения силовых...93ρ = 1036кг/м3 ). Таким образом, в итоге была определена сила захвата края эритроцита 29±3 пН при мощности излучения в ловушке 20 мВт. Эта сила пропорциональнамощности ловушки и ее можно выразить:Fesc = αP,(90)где P — мощность лазерного излучения в оптической ловушке, α = 1.45 ± 0.15пН/мВт.2.4. Определения коэффициента эффективной жесткости эритроцитаЗная максимальную силу оптического захвата края эритроцита, можно перейти к исследованию эластичных свойств эритроцита.
Для этого в эксперименте одиночныйэритроцит в плазме крови захватывался одновременно в две оптические ловушкиза противоположные края. Мощность лазерного излучения в первой ловушке была20 мВт. Меняя положение второй ловушки при различных мощностях лазерного излучения в ней, определяли максимальное удлинение эритроцита dl, которое можнодостичь, так чтобы эритроцит оставался захваченным обе ловушки. На рисунке 33бпредставлена зависимость этого растяжения, полученная с помощью обработки изображения растянутого эритроцита. Каждая точка получена усреднением по 10 экспериментальным реализациям.
При силах до 15 пН это удлинение можно аппроксимировать линейным законом с коэффициентом пропорциональности K = 13±2 пН/мкм.Погрешность этой величины во многом определяется неточностью определения удлинения посредством обработки видеоизображения. Во время эксперимента также регистрировалось максимальное смещение края эритроцита из первой ловушки dx. Можноопределить эффективную жесткость самой оптической ловушки, то есть силу, действующую на край эритроцита при смещении его из центра ловушки на единицусмещения. Для малых смещений сила оказалась пропорциональна смещению с к коэффициентом k = 9 ± 1 пН/мкм.Применение оптического пинцета для определения силовых...94Рис.
33: a) Смещение края эритроцита из первой ловушки при действии на него со стороны второй ловушкой силы Ftrap . На вставке показана схема проводимого эксперимента,dx — смещение края эритроцита из первой ловушки, dl — удлинение эритроцита, Fesc —максимальная сила, развиваемая при выбранной мощности лазерного излучения второй ловушки. б) Зависимость растяжения эритроцита под действием силы со стороны ловушекFtrap . Сплошные линии соответствуют линейным аппроксимациям участков зависимостейдо 15 пН.Применение оптического пинцета для определения силовых...952.5.
Применение метода активной реологии в оптическом пинцете для измерениявязко-упругих характеристик эритроцитаВыше мы получили жесткость ловушек и коэффициент упругости самого эритроцита в стационаром режиме. Есть актуальная задача динамического измерения упругиххарактеристик клеток. Например, детектирования изменения этих характеристик вовремени при действии на клетку различных веществ. Для решения этой задачи удобно эритроцит рассматривать как колебательную систему. Из анализа отклика этойсистемы на внешнее периодическое воздействие можно определить эластичные свойства системы.В эксперименте одиночный эритроцит в плазме крови захватывался одновременнодвумя оптическими ловушками за противоположные края клетки, как это схематичнопоказано на рисунке 34a. Эритроциты выбирались по микроскопии размером 8 мкм, асреднее расстояние между ловушками было равным 7,5 мкм, что соответствует практически недеформированному захваченному эритроциту.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
