Диссертация (1102496), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Она была измерена в зависимости от площадиперекрытия и времени взаимодействовали эритроцитов. Следует отметить, чтоэритроциты в растворах белков сильно взаимодействуют друг с другом, в пределахискусственно созданной площади взаимодействия, несмотря на отсутствие САЭ [141].60Характерные силы, необходимые для разделения эритроцитов, сопоставимы с силами вплазме крови при схожей концентрации изучаемых белков (фибриноген и альбумин)Процедура измерения силы FD в зависимости от времени взаимодействияэритроцитов показана на рисунке 3.4 (а). Она состояла из следующих этапов: (1) дваодиночных невзаимодействующих эритроцита захватывались двумя независимыми ЛП;(2) эритроциты сводились до перекрытия порядка 10 мкм2 и удерживались в контактеот 10 до 100 секунд; (3) эритроциты разводились до полной дезагрегации.
Поэтапноувеличивая силу захвата FTRAP с маленьким шагом (~ 0.5 пН), определялиминимальную силу, при которой эритроциты полностью дезагрегируют. Результатыизмерения, представленные на рисунке 3.4 (б), показывают, что FD эритроцитовпрактически не изменяется со временем во всех исследуемых средах.При дезагрегации эритроцитов в плазме мы наблюдали, что по мере ихразделения нужно увеличивать прилагаемую силу. Это согласуется с результатами,полученными другими авторами [103,118], В то же время в растворе декстрананаблюдался противоположный эффект: клетки разделялись полностью без увеличениясилы. Для количественной оценки и сравнения наблюдаемой разницы мы измерилизависимость сил при дезагрегации эритроцитов от смещения эритроцитов как показанона рисунке 3.5 (а). Процедура эксперимента была следующая: сначала два одиночныхневзаимодействующих эритроцита захватывались двумя независимыми ЛП; затемэритроциты сводились до перекрытия порядка 30 мкм2 и удерживались в контактеболее 10 секунд.
Затем эритроциты разводили путем передвижения одного из ЛП спостоянной скоростью порядка 0.1 мкм/с до тех пор, пока сила взаимодействия клеток(или сила при дезагрегации эритроцитов) не превысит силу захвата ЛП. Далее процессповторялся при увеличении силы FTRAP. Таким образом, получалась зависимость силвзаимодействия эритроцитов при дезагрегации эритроцитов от смещения эритроцитов.61В случае измерения в растворе декстрана вместо увеличения силы взаимодействия этасила уменьшалась по мере разделения клеток и, как показано на рисунке 3.5 (б), всегдаудавалось окончательно разделять клетки.Рис.
3.4. (а) Схема процедуры измерения силы дезагрегации. Крестиками отмеченыположения ЛП. Два эритроцита сводятся и удерживаются в контакте в течение некотороговремени (10-100 секунд). Затем измеряется сила, необходимая для их полного разъединения(FD). (б) Из результатов измерения видно, что с хорошей точностью можно считать, что FD(t) =const.Результаты измерений, представленные на рисунке 3.5 (б), показывают, что врастворах белков, плазме и сыворотке крови по мере разделения эритроцитов силавзаимодействия клеток возрастает и для достижения большего смещения эритроцитовтребуется большая сила [141].
Абсолютная величина силы FA в плазме и сывороткепочти на порядок меньше, чем FD. В случае измерений в растворе декстрананаблюдалось наоборот уменьшение силы, необходимой для разделения эритроцитов. В62этом случае наблюдается одинаковая зависимость как для ДАЭ , так и для САЭ, хотяFD > FA примерно в 2 раза.Рис. 3.5. (а) Схема процедуры измерения зависимости сил взаимодействия эритроцитов придезагрегации от относительного смещения клеток. Крестиками отмечены положения ЛП.
Дваэритроцита сводятся до перекрытия боковых поверхностей порядка 30 мкм2 (A ≈ 5-6 мкм).Один из эритроцитов оттягивается от другого до тех пор, пока сила взаимодействия клеток непревысит силу захвата ЛП и эритроцит не выскочит из ЛП. Процедура повторяется с пошаговос нарастающей силой. (б) Зависимость силы дезагрегации FD от смещения эритроцитов.Символы, относящиеся к растворам разных белков и к плазме, в которых были проведеныизмерения, отмечены разными цветами. Смещение рассчитывалось как ∆Si/S0, где S0 –начальная площадь взаимодействия эритроцитов; Si – площадь взаимодействия эритроцитов намомент отрыва эритроцита из ЛП при каждой из приложенных сил.Эффект возрастания силы при дезагрегации эритроцитовДля того, чтобы убедиться в наличии эффекта возрастания силы в динамикеДАЭ по мере разделения клеток, была проведена специальная серия измерений.Следует отметить, что в случае спонтанной агрегации эритроцитов, аналогичная серияизмерений показала отсутствие такого эффекта.
Было проведено измерение FD в63зависимостиот«начальной»(илимаксимальной)площадивзаимодействияэритроцитов. Процедура экспериментов схематически показана на рисунке 3.6.Измерения FD при маленьком «начальном перекрытии» (S0 ~ 10 мкм2) совпадают спроцедурой показанной на рисунке 3.4 (а). При большом «начальном перекрытии» (S0~ 30 мкм2) измерения проводились следующим образом: (1) два эритроцита сводилисьи удерживались в контакте в течение некоторого времени с этим перекрытием; (2)эритроциты разводились до перекрытия порядка ~ 10 мкм2 и удерживались в течениенекоторого времени; (3) при этом измерялась FD.Как показано на рисунке 3.6 (в), при большем «начальном» перекрытии FDзначительно выше и возрастает пропорционально перекрытию эритроцитов дляплазмы [139]. Таким образом, наглядно наблюдается эффект возрастания силывзаимодействия эритроцитов.
Этот эффект скорее всего связан с «эффективной»площадью взаимодействия эритроцитов. Не исключено, что через некоторое времяэтот эффект релаксирует, но в данной работе это не исследовалось. Этот вопростребует более детального изучения и наша дискуссия по наблюдаемому эффекту врамках механизмов взаимодействия клеток приведена в главе 4.Наши экспериментальные результаты показывают, что эритроциты в растворахбелков, хотя и не агрегируют спонтанно, но сильно взаимодействуют друг с другом,будучи приведенными в контакт с помощью ЛП. Для растворов белков, плазмы исыворотки крови наблюдается эффект возрастания силы взаимодействия FD по мереразведения клеток.
Следует отметить, что для процесса САЭ в плазме сила FA былапропорциональна «текущей» площади взаимодействия эритроцитов и эффектвозрастания силы не наблюдается. В то же время в растворах нейтральныхмакромолекул наблюдается одинаковая зависимость как для САЭ, так и для ДАЭ, иэффект возрастания силы взаимодействия также не наблюдается.64Рис. 3.6 Измерение силы при дезагрегации эритроцитов (FD) при различных значениях«начальной» площади взаимодействия эритроцитов. (а) Случай малого «начальногоперекрытия» (около 10 мкм2): два эритроцита сводятся и удерживаются в контакте в течениенекоторого времени с этим перекрытием, при этом измеряется FD; (б) Случай большого«начального перекрытия» (около 30 мкм2): два эритроцита сводятся и удерживаются вконтакте в течение некоторого времени с этим перекрытием, затем эритроциты разводятся доперекрытия порядка 10 µм2 (20%) и удерживаются в течение некоторого времени, при этомопять измеряется FD.
(в) В результате измерений наблюдается значительный рост FD приувеличении начального перекрытия (синий столбец - S ≈ 21 мкм2, красный – S ≈ 30 мкм2).Результаты измерений временной зависимости силы при спонтанной агрегациии дезагрегации эритроцитов показали, что для характерных времен от 10 до 100 секундизменений силы нет. По литературным данным результаты, полученные с помощьюлазерных пинцетов для плазмы и с помощью атомного силового микроскопа дляраствора декстрана, показывают, что силы взаимодействия эритроцитов резковозрастают течение первых 5 секунд контакта. Однако результаты дальнейшихизмерений имеют значительный разброс и являются недостоверными.
В то же времянаши результаты наглядно показывают, что сила взаимодействия эритроцитовнасыщается уже по прошествии первых 10 секунд взаимодействия клеток. В плазметакже наблюдается отличие абсолютных величин FA и FD почти на порядок. Это может65означать, что природа сил, собирающих эритроциты в агрегат (FA) и удерживающихагрегат от разрушения (FD) отличается. Более детальному обсуждению полученныхданных в свете механизмов взаимодействия эритроцитов посвящена глава 4.3.3 Сравнение параметров агрегации эритроцитов, измеренных на цельнойкрови и на индивидуальных клеткахКак отмечалось в первой главе, существуют два коммерческих прибора,позволяющих измерять динамические характеристики взаимодействия эритроцитов наобразцах цельной крови.
В частности, мы сравнили силы FA и FD, измеряемые спомощью ЛП, с параметром CSS, измеряемым с помощью агрегометра RheoScan [141].Параметр CSS по физическому смыслу коррелирует с FA. В литературе онопределяется как минимальное сдвиговое напряжение, удерживающее эритроциты отспонтанной агрегации или необходимое для разрушения агрегата. В то же время FAизмеряется путем сопоставления FTRAP с минимальной силой, необходимой дляудерживания эритроцитов от агрегации.
Сдвиговое напряжение по определениюявляется отношением силы, приложенной в нормальном направлении к некоторойплощади, к величине этой площади. Сдвиговое напряжение, создаваемое ЛП, можемполучить, поделив FA или FD на площадь взаимодействия эритроцитов друг с другом.Обозначим его как SASS (single cell aggregating shear stress) и SDSS (single celldisaggregating shear stress), соответственно.Для сравнительных измерений использовались кровь 10 молодых клиническиздоровых доноров мужского пола.
Измерения производились одновременно на ЛП и наагрегометре - RheoScan. На рисунке 3.7 показаны результаты сравнения, параметр CSSсопоставим и практически совпадает с SASS. В случае SDSS (S ≈ 10 мкм2) измеренноезначение превышало 1000 мПа (не показано на графике), что и следовало ожидать,исходя из разницы между FA и FD.66Наши результаты показывают сравнимость параметров, измеренных напопуляционном уровне (CSS) и на уровне отдельных клеток (SASS). Также показано,что определение CSS как минимального сдвигового напряжения, необходимого длядезагрегации эритроцитов является неверным.
Параметр SDSS значительно больше,чем SASS, при этом с увеличением перекрытия эритроцитов SDSS значительновозрастает. С другой стороны наши результаты объясняют независимость CSS отгематокрита и температуры [86]. Также мы подтверждаем предположение о том, что вротационной системе сдвиговое напряжение прикладывается менее эффективно, чем впроточной схеме [111]. Измерения, сделанные с помощью ЛП, можно считатьнаиболее прямыми и могут считаться контрольными.Рис. 3.7 Сравнение критического сдвигового напряжения CSS, измеренного на образцахцельной крови (RheoScan) и сдвигового напряжения при агрегации индивидуальных клетокSASS измеренного на отдельных клетках в плазме (лазерный пинцет).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
