Диссертация (1102496), страница 6
Текст из файла (страница 6)
В зависимости от модели силами образования агрегатаявляются либо осмотические силы в «модели обедненного слоя», либо силы адсорбциимакромолекул в «модели мостиков». [54,89].1.4.1. Модель «мостиков»Модель «мостиков» (cross-bridges) была разработана и использована дляописания взаимодействия эритроцитов в 70-е годы преимущественно на базе данных,полученных с помощью СЭМ и АМ [111]. Она описывает взаимодействие эритроцитовтак, что между эритроцитами образуются «мостики», состоящие из макромолекул.
Нарисунке 1.21 показана типичная картина взаимодействия посредством «мостиков».Адсорбируясь на поверхности эритроцитов, макромолекулы образуют «мостики» вобласти первоначального локального контакта. По мере сближения эритроцитовколичество мостиков растет, что приводит к дальнейшему притяжению эритроцитовдруг другу. В итоге образуется эритроцитарный агрегат [111].Хотя для данной модели не были сделаны количественные расчеты энергиивзаимодействия эритроцитов, была предложена следующая формула, описывающая этовзаимодействие:= e (2)Энергия взаимодействия эритроцитов, как энергия мостиков (EB), приходящаяся наединицу площади (Ai), рассчитываться как произведение энергии одного мостика (eb)на cсреднее количество мостиков приходящих на одну макромолекулу (bm) и наколичество макромолекул, способных формировать мостик, на единицу площади (m).[111]39В модели мостиков колоколообразнаяформазависимостиэнергиивзаимодействия эритроцитов от концентрации декстрана (см.
рисунки 1.12 и 1.14),объясняется увеличением потенциала мембраны эритроцитов при повышенииконцентрации декстранов и соответственно сил электростатического отталкивания.[89,111].Рис. 1.21. Схематические представление взаимодействия эритроцитов по модели «мостиков».Образование «мостиков» происходит за счет адсорбции макромолекул на обеих мембранахблизлежащих эритроцитов. Этот процесс ведет к спонтанному увеличению количествамостиков, и образуется агрегат [89].Важнейшим аргументом, поддерживающим модель, является корреляциямежклеточного расстояния с размерами макромолекул [89] и независимостьмежклеточного расстояния от наличия поверхностного заряда.
Другие аргументы былиполучены в экспериментах с использованием различных типов ингибиторов, таких какантагонистрецептораинтегринаArg-Gly-Asp-Ser(RGDS),ингибиторхлорид/бикарбонат-антипортера 4,4'-диизоциано-2,2'-стильбен-дисульфоновая кислота(DIDS), ингибитор рецептора CD47, ингибитор αIIbβ3. Использование ингибиторов40значительно уменьшало взаимодействие эритроцитов друг с другом в плазме крови. Вслучае DIDS ингибирование наблюдалось и для раствора декстранов. Эти данныеуказываютнаважнуюрольспецифическогосвязываниямакромолекулссоответствующими рецепторами мембраны эритроцита в агрегации эритроцитов[22,49,132,133].Весомым аргументом против этой модели является в свою очередь то, что безсторонних сил эритроциты не могут приблизиться друг к другу достаточно близко,чтобы образовать «мостик».
Мембрана эритроцита, будучи отрицательно заряженной,препятствует к этому. Хотя характерные силы малы по сравнению с агрегационными,до формирования агрегата их достаточно для того, чтобы не дать эритроцитамсблизиться на расстояние порядка длины макромолекул.1.4.2. Модель «обедненного слоя»В модели «обедненного слоя» для описания взаимодействия эритроцитовиспользуется концепция осмотических сил. В работах последних лет эта модельявляется превалирующей и, тем самым, является более проработанной, чем модель«мостиков».
Эта модель объясняет взаимодействие клеток за счет так называемых силобеднения (depletion forces), впервые описанных Асакурой и Осава на примерепритяжения тонких пластин, помещенных в раствор макромолекул [134]. Состояния, вкоторых могут находиться макромолекулы у поверхности пластин ограниченны, ипоэтому макромолекулы стремятся уйти с поверхности, что и влечет образованиеобедненного слоя. Взаимодействие эритроцитов объясняется образованием вокругэритроцитов обедненного макромолекулами слоя и возникающего осмотическогодавления.
Соприкасаясь друг с другом, эритроциты энтропийно увеличивают площадьобедненного слоя и удерживаются друг с другом за счет осмотического давления.41Схематическая иллюстрация взаимодействия эритроцитов по модели обедненного слояпоказана на рисунке 1.22.Рис. 1.22.Схематическая иллюстрация взаимодействия эритроцитов по модели«обедненного слоя». (I) образуется обедненный слой макромолекул у поверхностиэритроцитов; (II) сталкиваясь друг с другом за счет перекрытия обедненных слоев ивытеснения раствора из обедненного слоя в объем (серые стрелки), клетки спонтанно«наползают» друг на друга (черные стрелки).
(III) эритроциты спонтанно агрегированы иудерживаются силами осмотического давления [5].В рамках модели «обедненного слоя» был предложен способ расчета энергиивзаимодействияэритроцитов.Этамоделькомбинируетэлектростатическоеотталкивание за счет заряда поверхности эритроцитов и осмотическое давление за счетобеднения макромолекул вблизи поверхности эритроцитов. При этом учитываетсямягкость поверхности эритроцитов (гликокаликс) и возможность проникновениямакромолекул в эту поверхность. С увеличением концентрации макромолекулусиливается осмотическое давление, но в то же время макромолекулы большепроникаютвмягкуюповерхностьэритроцитовиуменьшаютобедненноевзаимодействие.
Глубина проникновения макромолекул в гликокаликс зависит от их42концентрации и размера: чем меньше размер молекул, тем глубже проникают они вгликокаликс. Она также увеличивается с ростом концентрации макромолекул в силуувеличения осмотического давления. Таким образом после определенной пороговойконцентрации макромолекул эффект от проникновения макромолекул в гликокаликсстановится доминирующим, и уменьшается энергия взаимодействия клеток. Этимобъясняется колоколообразная зависимость АЭ от концентрации макромолекул,наблюдаемая в эксперименте (см. рисунок 1.12, 1.14) [5]. Энергия взаимодействияэритроцитов в модели обедненного слоя рассчитывается по формуле:d = 2π (∆ − 2 + ∂ − p)(3)Здесь π – осмотическое давление, ∆ - толщина обедненного слоя, d – расстояние междуповерхностями, δ – толщина гликокаликса и p – глубина проникновения макромолекулв гликокаликс.
Более подробное обсуждение этой модели содержится в работах[5,54,105].В качестве важнейшего аргумента, доказывающего отсутствие «мостикового»взаимодействия при агрегации эритроцитов и соответственно поддерживающегомодель «обедненного слоя», выступает отсутствие мостиков при использованииковалентно прикрепленных к мембране эритроцитов макромолекул PEG (35 кДа). В тоже время, находясь в растворе, PEG 35 кДа является сильным проагрегантом [135-137].В настоящее время взаимодействие эритроцитов при агрегации многимпредставляетсядетальноизученнымфундаментальныхработпосвященоиндуцированногонейтральнымииследуетотметить,рассмотрениюмакромолекулами.чтобольшинствовзаимодействияОднакоклеток,убедительныхэкспериментальных результатов по сравнению эффектов взаимодействия эритроцитовв растворах нейтральными макромолекул и в нативной среде существенно меньше.Таким образом, имеется потребность исследования взаимодействия эритроцитов при43их спонтанной агрегации и дезагрегации, особенно в плазме и в растворах белковплазмыкрови.Подобноеисследованиепозволитуглубитьсявпониманиебиофизических механизмов взаимодействия эритроцитов между собой.44Глава 2.
Материалы и методыВо второй главе описаны экспериментальные установки, использованныев работе, а также протоколы подготовки образцов и проведения измерений. Описаныпроцедуры измерения параметров, характеризующих САЭ и ДАЭ, и процедурыанализа полученных данных. Описаны также принцип работы и измеряемыепараметры коммерческого агрегометра RheoScan, использованного для сравненияпараметров, получаемых на уровне индивидуальных клеток и цельной крови.2.1 Материалы2.1.1 Выбор растворов и кровиВыбор растворовВ данной работе для исследования АЭ были использованы следующие среды,индуцирующие АЭ: (1) аутологичная плазма; (2) аутологичная сыворотка, (3)модельные растворы на основе PBS (фосфат-буферного раствора), содержащие белкикрови (фибриногена и альбумина как по отдельности, так и в совокупности), (4)модельный раствор на основе PBS, содержащий нейтральные макромолекулы(декстран 500 кДа).
Такой выбор сред был обусловлен тем, что фибриноген являетсяодним из основных белков, определяющих реологию крови [44,45], и наблюдаетсясинергетический эффект фибриногена с альбумном и γ-глобулином, усиливающий АЭ[45,46]. Декстран рассматривался как пример нейтральных макромолекул, широкоиспользуемыхдляизучениямеханизмов взаимодействияприАЭ,атакже«агрегируемости» эритроцитов [54,105].Забор кровиКровь для экспериментов забиралась из пальца или из локтевой вены человека,в зависимости от эксперимента. В качестве антикоагулянта использовался ЭДТА(этилендиаминтетрауксусная кислота). В основном во избежание разброса параметров45за счет индивидуальных отличий для набора значимой статистики использоваласькровь одного клинически здорового донора мужского пола.
Качественные измеренияпроводились и на пробах крови других доноров для проверки наблюдаемыхзависимостей. Большинство экспериментов проводились при комнатной температуре.Эксперименты проводились in vitro в течение нескольких часов после взятия кровисогласно рекомендациям международного общества клинической гемореологи, т.к. впределах четырех часов отклонения параметров АЭ со времени минимальны [87].2.1.2. Подготовка образцаПодготовка сред, индуцирующих агрегацию эритроцитовПлазмакровиподготавливаласьочищеннойоттромбоцитовсогласноследующему протоколу. Цельная кровь сразу после забора крови центрифугироваласьв течение 10 минут при 2,000 g при комнатной температуре.
Эритроцитарная массаотделялась от плазмы. Очищенная от эритроцитов плазма дважды центрифугироваласьв течение 10 минут при 11,000 g при комнатной температуре для удаления остатковклеток, в частности, тромбоцитов. Удаление тромбоцитов являлось одной изважнейших процедур для успешного проведения измерений. Тромбоциты, будучизахваченными в оптическую ловушку при медленном оседании, препятствовалиточным измерениям сил.Сыворотка крови подготавливалась в специальной пробирке (BD Vacutainer) постандартной процедуре.
В пробирке содержался гель, разделяющий тромб отсыворотки, а также активатор на базе тромбина, ускоряющий тромбообразование.Кровь забиралась в пробирку и отстаивалась при комнатной температуре в течение 20минут до образования тромба. Затем кровь центрифугировалась в течении 20 минутпри 1,500 g при комнатной температуре и тромб отделялся от сыворотки крови слоемразделительного геля. Сыворотка крови забиралась и отмывалась повторным46центрифугированием в течение 10 минут при 11,000 g при комнатной температуре дляудаления возможных остатков клеток.Модельные растворы белков или нейтральных макромолекул подготавливалисьв PBS (10 мМ Na2HPO4, 1.76 мМ KH2PO4, 2.7 мМ KCl, 137 мМ NaCl, осмолярность 300мОсм/кг, pH 7.4,). Растворы белков и нейтральных макромолекул хранились притемпературе 4°C и могли использоваться в течение 1 недели после подготовки.Подготовка образцаВ подготовленные растворы добавлялась малое количество крови, доляэритроцитов в растворе составляла порядка 0.05%.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
