Диссертация (1102496), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Такое сильное разбавлениеэритроцитов в растворе было необходимо для работы с одиночными клетками. Кровь,взятая из пальца, помещалась сначала в PBS и отмывалась дважды путемцентрифугированиявтечениецентрифугированиязаменялся10PBS.минутЗатемпри3,000забиралосьg.Послемалоекаждогоколичествоэритроцитарной массы и добавлялось в нужный модельный раствор.Подготовка экспериментальной кюветыДляпроведенияэкспериментовподготавливаласьспециальнаякювета,состоящая из предметного и покровного стекол, разделенных двухсторонним скотчем.Схематически кювета показана на рисунке 2.1.
Высота кюветы измеряласьмикрометром и составляла порядка 100 мкм, объем помещаемого образца составлялпорядка 60 мкл. Две стороны кюветы состояли из разделяющего двухстороннегоскотча, а две другие стороны герметизировались вазелином.Стекла передиспользованием обрабатывались 98% этиловым спиртом и высушивались.В растворах, не содержащих альбумин, наблюдалось прикрепление эритроцитовк стеклу и постепенное превращение их в эхиноциты.
Для предотвращения этогопроцесса,поверхностьпредметногостеклаобрабатывалась1%раствором47человеческого альбумина в PBS. 5 мкл раствора распределялось по поверхностикюветы и высушивалось в течение 10 минут. Таким образом, эритроциты непревращались в эхиноциты и не прикреплялись к поверхности стекла. В случае работыс раствором декстрана, не смотря на покрытие альбумином, эритроциты продолжалиприкрепляться к поверхности стекла.
Однако покрытие альбумином предотвращалопревращение эритроцита в эхиноцит. С силу этого концентрация эритроцитов врастворе макромолекул бралась в 10 раз выше (0.5%). Таким образом создавалосьмножество слоев эритроцитов на поверхности стекла, и отделять эритроциты дляизмерений было легче.Рис. 2.1. Схематическое изображение экспериментальной кюветы (не в масштабе).
(а) Видсверху, (б) вид в разрезе сбоку. Элементы: 1) предметное стекло; 2) двухсторонний скотч; 3)покровное стекло; 4) вазелин; 5) термопара; 6) исследуемый образец.2.2. Лазерный пинцетЛазерный пинцет (ЛП) использовался как основная экспериментальнаяустановка для изучения взаимодействия эритроцитов при их агрегации. Дляэкспериментов была собрана установка двухканального ЛП, специализированная дляизмерений сил взаимодействия между эритроцитами [117].
Схема установки показанана рисунке 2.2. Основными элементами установки являются твердотельный лазер48Nd:YAG с диодной накачкой (λ = 1064 нм, 350 мВт) и водно-иммерсионный объектив свысокой числовой апертурой (NA = 1.00). Лазерный пучок разделялся на дваодинаковых пучка поляризационным кубом для создания двух каналов ЛП. Пучкирасширялись телескопами до размера, немного превышающего размер заднейапертуры объектива, и вводились в кювету через заднюю апертуру объектива. Такимобразом формировались две оптические ловушки на образце, содержащем эритроциты.Мощность лазерного излучения каждого из каналов регулировалась с помощьюполуволновых пластин и поляризационного куба. Положение оптической ловушкиизменялось с помощью зеркала, находящегося в сопряженной плоскости с заднейапертурой объектива.
Поворот моторизованного зеркала позволял перемещатьположение оптической ловушки со скоростью от 0.1 мкм/с до десятков мкм/с. Дляперемещенийпообразцуиспользовалсямоторизованныйтрех-координатныйпредметный столик, который может перемещаться вдоль каждой оси со скорость от 1мкм/с до нескольких мм/с. Изображение эритроцитов в процессе экспериментазаписывалось в режиме пропускания на CMOS камеру.Важным вопросом при работе с эритроцитами являлся их нагрев и изменениесвойств клетки в сфокусированном лазерном пучке.
Этот эффект в нашем случаепренебрегался т.к. длина волны излучения лазеров приходится на окно прозрачностикрови, а мощность лазерного излучения в каждом пучке не превышала 30 мВт.Эффективный теплоотвод производился за счет суспендирующей среды, и времяконтакта лазерного пучка с клеткой в наших экспериментах не превышало 3-5 минут.Как показано в обзоре, представленном в Главе 1, нагрев эритроцита составляетпорядка 1°C, на каждые 10 мВт мощности лазерного излучения.
Проведенные намидополнительные эксперименты показали, что при удержании эритроцита с помощью49ЛП в течение 15-ти минут необратимых морфологических изменении клетки непроисходит.Рис. 2.2. Упрощенная схема экспериментальной установки двухканального лазерного пинцета(описание в тексте).2.2.1. Калибровка лазерного пинцетаКалибровка силы захвата ЛП производилась путем сравнивания силы захватаЛП с силой вязкого трения, действующей на захваченный ловушкой эритроцит впотоке. Для этого одним каналом лазерного пинцета захватывался один эритроцит исоздавался поток путем передвижения предметного столика с кюветой.
При заданноймощности ЛП скорость потока постепенно увеличивалась с маленьким шагом (2.5мкм/с) до тех пор, пока эритроцит не вырвется из ЛП. Схематически процедураэксперимента показана на рисунке 2.3 (а). Эксперимент повторялся на каждомэритроците 5 раз, для калибровки использовались 15 эритроцитов.
Процедураповторялась для 5 разных мощностей ЛП. Сила вязкого трения рассчитывалась поформуле 4, учитывающей несферичность эритроцита [138]. Сила вязкого трения50сопоставлялась с силой захвата ЛП, и находился коэффициент пропорциональностисилы захвата ЛП и мощности лазерного излучения. = 6πηr=(4)4 23 (β − 1)1(2β2 − 1)ln [β + (β2 − 1)2 ] − β21/2(β − 1)β=aЗдесь β – отношение полуосей эллипсоида, K – поправочный коэффициент дляэллипсоида, η – динамическая вязкость среды, r – радиус эквиобъемной сферы.Рис. 2.3. Процедура калибровки лазерного пинцета. (а) Эритроцит захватывается с помощьюЛП и находится в покое; (б) создается поток с пошагово увеличивающейся скоростью; наопределенной скорости эритроцит вырывается из ЛП, и сила вязкого трения сопоставляется ссилой захвата ЛП при данной мощности.2.2.2.
Принцип измерения сил взаимодействия между эритроцитами спомощью лазерного пинцетаВнашейработеизмерялисьнесколькопараметров,характеризующихвзаимодействие эритроцитов. Мы ограничивались взаимодействием пары эритроцитов.Параметры разделялись на две группы: (1) первая группа относилась к измерениям51параметров САЭ, как процесса самопроизвольного «наползания» пары эритроцитовдруг на друга после образования локального контакта; (2) вторая группа относилась кпараметрам ДАЭ, как процесса искусственного разъединения пары эритроцитов спомощью ЛП.Измерялись силы, необходимые (1) для удержания эритроцитов от спонтаннойагрегации (сила при спонтанной агрегации эритроцитов - FA) и (2) для разделения ужесоединенных эритроцитов (сила при дезагрегации эритроцитов - FD).
Схематическаяпроцедура измерения указана на рисунке 2.4. Собирается искусственный агрегат издвух эритроцитов, как показано на рисунке 2.4 (а). Силы взаимодействия эритроцитовизмерялись сопоставлением их с силой захвата ЛП, как показано на рисунке 2.4 (б, в).FA – минимальная сила, необходимая для удержания эритроцитов от спонтаннойагрегации. Эритроциты захватываются в два независимых канала ЛП и подводятся доконтакта друг с другом. Сила FA действует так, чтобы эритроциты перекрылись, аFTRAP действует в обратном направлении. До тех пор, пока FTRAP > FA клеткисамопроизвольно не «наползают» друг на друга. При постепенном уменьшении силыFTRAP в определенный момент сила FA начинает превышать силу FTRAP, и эритроцитыначинают спонтанно «наползать» друг на друга.
В этот момент FTRAP считается равнойFA. Такой подход был возможен в силу того, что для разделения клеток требуетсязначительно большая сила, чем для удержания их от спонтанного «наползания», какбудет показано далее в Главе 3. Подобным образом измерялась и минимальная сила,необходимая для дезагрегации эритроцитов, как это показано на рис. 2.4 (в). Болееподробно процедура измерения представлена в Главе 3 вместе с результатамиизмерений.52Рис 2.4. (а) схематическое представление процесса сборки агрегата из двух эритроцитов. ЛПпозволяет собрать агрегат с прецизионно контролируемым перекрытием и проследить задинамикой процесса.
(б) Схематическое представление процесса измерения силы приспонтанной агрегации эритроцитов: при F1 > FA и F2 > FA клетки покоятся, при F3 < FA клеткиспонтанно агрегируют. (в) Схематическое представление процесса измерения силы придезагрегации эритроцитов: при F1 < FD и F2 < FD клетки разделяются только частично, при F3 >FD клетки полностью дезагрегируют.2.2.3. Обработка данныхОбщий объем измерений, проведённых в данной работе, был выполнен на более,чем 2,000 парах эритроцитов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
