Диссертация (1102496), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Сравнительно недавно использование лазерных пинцетов (ЛП)позволило получить данные по динамике взаимодействия эритроцитов. Метод ЛПимеет преимущество над другими методами (АМ, АСМ, СЭМ и пр.) в том, чтопозволяет прецизионно манипулировать клетками и измерять силы взаимодействия сточностью до долей пиконьютонов, что трудно осуществимо другими методами. Этивозможности показали перспективу в изучении взаимодействия эритроцитов друг сдругом.Метод ЛП является основным метод в данной диссертационной работе,поэтому результаты, полученные с помощью ЛП, будут рассмотрены подробнее.1.3.3ИспользованиелазерныхпинцетовдляизученияагрегацииэритроцитовBronkhrost и соавторы были первыми, кто использовал ЛП для изучениявзаимодействия эритроцитов [103]. Правда измерения силы не были проведены и АЭбыла изучена качественно.
Были сделаны выводы, что при дезагрегации эритроцитовпо мере разделения эритроцитов в плазме взаимодействие клеток усиливается. Такженаблюдаласьвременнаязависимостьвзаимодействия:эритроцитылегкодезагрегировали в первые несколько секунд взаимодействия, но по истечению 5-8секунд взаимодействие становилось слишком сильным, чтобы их можно былоразделить при использовавшихся мощностях лазерных пучков [103]. В более позднихработах были сделаны количественные измерения сил взаимодействия эритроцитов[117-119].
Сила, необходимая для дезагрегации эритроцитов, составила порядка 10 пН.При этом наблюдалось значительное увеличение силы, необходимой для разделенияэритроцитов по мере их дезагрегации в плазме. Были измерены характерные скоростиСАЭ, которые составили порядка 0.3 мкм/с [118]. Также был измерен зета-потенциалотдельных эритроцитов [120]. Но детального исследования агрегации эритроцитов в32целях развития механизмов взаимодействия эритроцитов не было произведено.
Тем неменее, полученные с помощью ЛП результаты показали возможность детальногоизучения взаимодействия эритроцитов, что до этого было недоступным.Рис. 1.15. (а) Зависимость силы захвата и максимально достижимого линейного расстояниямежду эритроцитами. (б) Процедура измерения. Для разделения эритроцитов необходимоприкладывать возрастающую силу. Светлые кружки показываю места приложения оптическихловушек [118].Принцип оптического захватаЛазерный пинцет (ЛП) был впервые предложен Артуром Ашкинм в 1970 году[121].
ЛП позволяет захватывать и манипулировать одиночными диэлектрическимимикрочастицами с помощью жестко сфокусированного лазерного излучения, и принадлежащей калибровке ЛП позволяет измерять силы от субпиконьютон до сотенпиконьютон. Neuman. Использование возможностей ЛП позволило сделать прорыв вобласти биофизики в последние два-три десятилетия, когда они стали применяться дляизмерения сил взаимодействия клеток и макромолекул [122-126] Подробное описание33оптического захвата изложено в обзорной статье, здесь приведено только краткоеописание принципа работы [127].Рис. 1.16. Схематическое изображение оптического захвата в приближений геометрическойоптики.
Оптическая ловушка формируется жестко фокусированным лазерным пучком,создающим трехмерный градиент интенсивности. При преломлении лучей на частицепроисходит изменение моментов сил, с которыми свет взаимодействует с частицей. Врезультате частица притягивается к области вблизи фокуса (светлые стрелки показываютнаправления сил, черные стрелки показывают направление парциальных лучей в лазеромпучке).Принцип оптического захвата для частиц размера, значительно большего, чемдлина волны лазерного излучения представлен на рисунке 1.16. Процесс захватамикрочастицыобъясняетсязакономсохраненияимпульса.Сфокусированныйлазерный пучок преломляется на частице и суммарное изменение импульса квантасвета удерживает частицу [127] вблизи фокуса сфокусированного лазерного пучка.Эффективность захвата зависит от характера распределения интенсивности в пучке иот показателя преломления частицы.
При этом сила захвата определяется следующимсоотношением: =(1)34где FTRAP – сила захвата, Q – эффективность захвата, P – мощность лазерногоизлучения, n – показатель преломления среды, c – скорость света в вакууме.Оптический захват применим и для захвата частиц, размеры которыхзначительно меньше, чем длина волны лазерного излучения (см. подробности вобзорной работе [127]). В данной работе этот случай рассматриваться не будет.Калибровка лазерного пинцетаДля измерения сил с помощью ЛП необходима его калибровка. Калибровкапроизводится путем сравнения силы, действующей со стороны ЛП, с известнойвнешней силой.
Здесь мы ограничимся только описанием активного способакалибровки с помощью силы вязкого трения. Подробности о других способахкалибровки ЛП приведены в обзорной работе [127].*Рис. 1.17. Представление оптического захвата частицы, как прикрепление её к пружине(оптической ловушке).Частица, захваченная с помощью ЛП, может считаться прикрепленной кпружине с определенной жесткостью k, как показано на рисунке 1.17. При отклонениичастицы от центра ЛП на нее действует возвращающая сила FTRAP. Величина этой силы35зависит от того, насколько частица отдалена от положения равновесия, и может растидо определенного максимального значения, определяемого эффективностью захвата.Эту силу можно найти, сравнивая её с известной силой вязкого трения (FVISC),действующей на захваченную частицу в потоке жидкости с известным коэффициентомвязкости (рисунок 1.18).
При постепенном увеличении скоростипотока и,соответственно, FVISC частица в определенный момент выскакивает из оптическойловушки. В этот момент FTRAP = FVISC и соответствует максимальной возвращающейсиле ЛП. Таким образом, можно получить коэффициент, определяющий зависимостьFTRAP от мощности лазерного излучения. Как правило эта зависимость линейная.Рис. 1.18. Процедура калибровки лазерного пинцета с помощью силы вязкого трения. Назахваченную частицу действует сила вязкого трения и сила оптического захвата. Скоростьпотока постепенно увеличивают при постоянной мощности лазерного пучка (а-б) и вопределенный момент сила вязкого трения начинает превышать силу оптического захвата,вырывая частицу из ловушки.
Повторяя этот эксперимент при разных мощностях лазерногоизлучения, получаем калибровочную кривую для силы оптического захвата.Оптический захват применительно к агрегации эритроцитов. Как эритроцитзахватывается в лазерном пинцете?Как отмечалось выше, оптический захват применим для захвата эритроцитов,хотя они и не являются сферическими частицами. Попадая в область вблизи36сфокусированного лазерного пучка, эритроцит разворачивается под действием силызахвата так, что большая ось симметрии совпадает с оптической осью пучка.Схематически процесс захвата эритроцита показан на рисунке 1.19. Для того, чтобыподнять эритроцит с поверхности стеклянной подложки, требуется большая мощностьЛП, чем для того, чтобы удержать его в захваченном состоянии.
При этом взависимости от мощности ЛП для того, чтобы поднять эритроцит с подложкитребуется время от нескольких до десятков секунд. С помощью ЛП захваченнымэритроцитом можно свободно манипулировать.Рис 1.19. Процесс захвата эритроцита лазерным пинцетомВлияние сфокусированного лазерного излучения на эритроцитВажным вопросом при использовании ЛП для изучения биологических клетокявляется возможное влияние на них сфокусированного излучения, в частности,тепловое[117,128-130].Здесьмыопишемработыпоизучениювлияниясфокусированного лазерного излучения в ЛП на свойства эритроцита. Как правило, вЛП используется излучением в диапазоне окна прозрачности клеток. На рисунке 1.20показан спектр поглощения основных компонентов эритроцита – оксигенированного идезоксигенированного гемоглобина, а также воды [131].При использованииизлучения в ближнем ИК диапазоне достигается минимальное поглощение этого37излучения клетками.
Результаты расчетов разных авторов показали, что с учётомбольшого объема теплоотводящей суспендирующей жидкости вокруг эритроцита егонагрев составляет порядка 1°С на каждые 10 мВт лазерного излучения [128,129]. Приэтом отмечалось, что даже при долговременном удержании эритроцита в ЛП,заметного изменения в его морфологии не наблюдается.
Изучение влияния ЛП насвойства белков, проведенное путем анализа их спектров комбинационного рассеяния,показало, что значимых изменений не наблюдается [129,130].Рис. 1.20. Спектры поглощения основных компонентовдезоксигемоглобина (Hb) и оксигемоглобина (HbO2).
[131]эритроцита:воды(H20),1.4. Гипотетические модели механизмов взаимодействия эритроцитовНабаземногочисленныхисследованийбылипредложенымодели,описывающие механизм взаимодействия эритроцитов при их агрегации. На данныймомент существуют две основные модели взаимодействия эритроцитов «модельобедненного слоя» и модель «мостиков» [1]. В данном параграфе мы кратко опишемэти модели.38Взаимодействие эритроцитов при их агрегации происходит в направлениибаланса различных сил, приводящих к образованию агрегата или к его разрушению[111]. К последним относятся силы электростатического отталкивания, натяжениямембраны и сдвиговые силы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
