Диссертация (1102496), страница 8
Текст из файла (страница 8)
При этом для выполнения одной серии измерений,включающей 10-20 клеток, затрачивалось 5-7 часов с учётом всех подготовительных итехническихпроцедур.Погрешностиизмеренийрассчитывалиськаксуммасреднеквадратичных отклонений измеренных параметров и методической ошибкиизмерений. Последняя вносила значительный вклад в измерения сил ввидупогрешности калибровки силы захвата ЛП, которая составляла 15%. Также впогрешность полученных результатов вносили вклад индивидуальные отличияэритроцитов друг от друга.Помимо силы взаимодействия эритроцитов один из основных параметров площадьвзаимодействияэритроцитовполучаласьпоизмерениюлинейного53перекрытия эритроцитов (А) и пересчета в площадь перекрытия двух дисков (S), какпоказано на рисунке 2.5.Рисунок 2.5.
Иллюстрация измерения линейного перекрытия и площадивзаимодействия эритроцитов. (а) кадр из эксперимента, (б) схематическое представление связилинейного перекрытия и площади перекрытия двух дисков – простейших моделей эритроцитов.2.3 Измерение агрегации эритроцитов на цельной крови и сравнение сизмерениями на индивидуальных клеткахДля измерений АЭ на цельной крови использовался агрегометр RheoScan.Прибор позволяет измерять критическое напряжение сдвига – параметр CSS,определяемый в литературе как минимальное сдвиговое напряжение, останавливающееэритроциты от спонтанной агрегации или разрушающее агрегат [83].
Параметр CSSудобен для сравнения, т.к. он является независимым от гематокрита в пределах 30-60%и не изменяется в температурном диапазоне от 20 до 38°C. Схематично этотагрегометр представлен на рисунке 2.6 (а). Создание регулируемого сдвиговогонапряжения в потоке крови осуществляется с помощью механизма созданияизменяющего давления в капилляре.
Степень АЭ измеряется по интенсивностиобратно рассеянного лазерного излучения. Для измерений 0.5 мл цельной кровидобавляетсяводноразовуюмикро-проточнуюкювету.Процедураизмеренийследующая: (1) быстро спадающее давление прилагается на образец крови и он54начинает проходит через микрососуд; (2) высокое сдвиговое напряжение разрушаетагрегаты и интенсивность обратно рассеянного света увеличивается; (3) сдвиговоенапряжение падает и в определенный момент интенсивность обратно рассеянногосвета начинает уменьшаться.
В этот момент эритроциты перестают дезагрегировать иначинают спонтанно агрегировать. Точка изгиба считается критической точкой, вкоторойсдвиговоенапряжениеуравновешиваетспонтаннуюагрегациюидезагрегацию эриртоцитов. Типичный результат измерений представлен на рисунке 2.6(б).Рис. 2.6. (а) Упрощенная схема агрегометра RheoScan. (б) Временная зависимостьинтенсивности обратно рассеянного света и сдвигового напряжения. Точка перегибазависимости интенсивности рассеянного света соответствует критическому сдвиговомунапряжению [101].Согласно определению сдвигового напряжения параметр CSS можно сравнить спараметром, измеряемым с помощью ЛП.
Сдвиговое напряжение определяется какотношения силы, приложенной тангенциально вдоль некоторой площади. Такимобразом, сила спонтанной агрегации может быть преобразована в сдвиговоенапряжение. Сравнение параметров, измеренных на образце цельной крови и наиндивидуальных клетках, будет приведено в конце Главы 3.55Глава 3. Измерение агрегации эритроцитов с помощьюлазерного пинцетаВ данной главе представлены результаты измерения параметров спонтаннойагрегации (САЭ) и дезагрегации эритроцитов (ДАЭ) в различных индуцирующихагрегацию средах с помощью лазерного пинцета.
Проведены анализ полученныхэкспериментальных данных и их сравнение между собой и с литературными данными.Результатыизмерений,выполненныхспомощьюлазерногопинцетанаиндивидуальных клетках, также сравнены с результатами измерений, выполненных спомощью агрегометра RheoScan на образцах цельной крови.3.1. Измерение параметров спонтанной агрегации эритроцитовВ данном разделе описаны результаты исследования динимики спонтаннойагрегации эритроцитов (САЭ). Изучался процесс, при котором два эритроцитасамопроизвольно «наползают» друг на друга без участия сторонних сил послеобразования локального контакта.
Измерялись следующие параметры:(1) скорость спонтанной агрегации эритроцитов VA - это скорость «наползания»эритроцитов друг на друга после образования локального контакта.(2) сила при спонтанной агрегации эритроцитов FA – это латеральная силавзаимодействия, с которой эритроциты действуют друг на друга во время«наползания».Измерение скорости САЭНа рисунке 3.1(а) схематически показана процедура измерения скорости САЭVA.
Она состояла из следующих этапов: (1) два невзаимодействующих эритроцитазахватывались двумя независимыми ЛП; (2) эти эритроциты сводились до площадиперекрытия порядка S ≈ 10 µм2 и удерживающие эритроциты пучки ЛП отключались;(3) эритроциты самопроизвольно «наползали» друг друга в тех средах, в которых САЭ56имеет место. Скорость VA определялась как отношение линейного перекрытияэритроцитов к промежутку времени, в течение которого оно произошло. Порезультатам измерений было показано, что VA практически постоянно в течение всегопроцесса «наползания» клеток, как видно из графика зависимости площадиперекрытия эритроцитов от времени, представленного на рисунке 3.1 (в).
При этомисключались несколько первых секунд до начала «наползания», когда эритроцитыпрактически неподвижны, а также время торможения «наползания» эритроцитов послепрактически полного перекрытия эритроцитов. Результаты измерений для всехисследованных растворов представлены на рисунке 3.2. Характерные скорости: VA =0.34 ± 0.18 мкм/с (плазма), VA = 0.17 ± 0.15 мкм/с (сыворотка), VA = 0.29 ± 0.12 мкм/с(декстран). В растворах белков фибриногена и альбумина как по отдельности, так и всовокупности САЭ не происходила и VA = 0.Рис. 3.1. (а-б) Схема процедуры измерения скорости спонтанной агрегации эритроцитов.Крестиками отмечены положения ЛП. Два эритроцита сводятся до локального контакта иотпускаются, после чего эритроциты самопроизвольно «наползают» друг на друга в тех средах,в которых САЭ имеет место.
(а) в аутологичной плазме, сыворотке и в растворе декстрана САЭпроисходит; (б) в белковых растворах САЭ не происходит; (в) Измерение скорости САЭ какзависимости линейного перекрытия эритроцитов от времени (на примере плазмы).57Измерение силы при спонтанной агрегации эритроцитов (FA)Сила FA измерялась как показано на рисунке 3.3 (а). Процесс измерения состоялиз следующих этапов: (1) два эритроцита захватывались двумя ЛП; (2) эти эритроцитысводились до определенного перекрытия и удерживались; (3) затем сила FTRAP,постепенно уменьшалась до тех пор, пока FA не превысит ее.Рис.
3.2. Результаты измерений скорости спонтанной агрегации эритроцитов. Разными цветамиотмечены среды, в которых проводились измерения.Результаты измерений, представленные на рисунке 3.3 (б), показывают, что вплазме FA = 1.5 ± 0.5 пН и 4.5 пН ± 1.4 пН для площадей взаимодействия S = 10.3 ± 1.1мкм2 и 20.7 ± 2.2 мкм2 мкм соответственно [139]. Таким образом, FA растет приувеличении S . Изучение временной зависимости FA для времен взаимодействия от 10до 100 секунд показало, что силы взаимодействия практически не изменяются (см. рис.3 (в)). В других растворах измерения проводились только для одного значения S. В58растворе декстрана (500 кДа, 5 мг/мл) FA = 1.8 ± 0.5 пН для S = 19.1 ± 4.4 мкм2.
Всыворотке FA = 0.8 ± 0.4 пН для S = 14.7 ± 3.4 мкм2.Рис. 3.3. (а) Схема процедуры измерения силы при спонтанной агрегации эритроцитов - FA.Крестиками отмечены положения ЛП. Стрелками отмечены направления сил. (б) Результатыизмерений FA(S) в плазме, наблюдается увеличение силы взаимодействия клеток вместе сплощадью взаимодействия клеток. (в) Временная зависимость FA в плазме и в растворедекстрана.Значения FA и VA сильно зависят от состава среды. В сыворотке по сравнению сплазмой крови наблюдается замедленная и ослабленная агрегация, что показывает рольфибриногена в процессе САЭ [140]. Тем не менее, в модельных растворах фибриногенни сам по себе, ни в совокупности с альбумином не вызывает САЭ [141].Следовательно в процессе САЭ ключевую роль играет синергетический эффект59фибриногена с другими компонентами крови. Более того, для индуцирования САЭнедостаточно наличия только белков фибриногена и альбумина. Следует учесть, чтопомимо фибриногена известно порядка 10 белков, которые также влияют на АЭ[1,44,45,51].
Также нельзя исключать возможность того, что имеются компонентыплазмы крови, которые не считаются сами по себе ни проагрегантами, ниингибиторами, как альбумин, но в совокупности могут изменять агрегационныепараметры. Таким образом, можно заключить, что даже инициация САЭ – этокомплексный процесс, который еще требует детального изучения. Ключевая рольфибриногена, по крайней мере в САЭ, проявляется только в комплексе с другимикомпонентами плазмы крови.В растворах нейтральных макромолекул, наблюдается САЭ, сравнимая с той,что происходит в плазме и сыворотке крови. Таким образом, судя только поизмерениям САЭ, характер взаимодействия эритроцитов в плазме и в растворенейтральных макромолекул совпадает.
Однако, как показано далее по измерениямпараметров ДАЭ, взаимодействие клеток в растворах нейтральных макромолекул и вплазме значительно отличается.3.2. Измерение параметров дезагрегации эритроцитовПараметры ДАЭ измерялись в процесс разделения с помощью ЛП клеток вискусственно образованном агрегате, состоящем из двух эритроцитов. Два эритроцитасоединяли с помощью ЛП в агрегат и измеряли силу, которую нужно приложить дляего дезагрегации FD. Сила дезагрегации – это сила, необходимая для полного иличастичного разделения эритроцитов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
