Диссертация (1102496), страница 4
Текст из файла (страница 4)
В последниегоды для исследований АЭ наиболее широко используются несколько типовкоммерческих агрегометров. Это LORCA, Myrenne aggregometer и RheoScan [93,97,98].В этих приборах для приложения сдвигового напряжения на клетки используют либокюветы на основе двух соосных цилиндров или системы «конус-пластин», либопроточную камеру, соответственно. Схема типичного агрегометра с кюветой на основедвух соосных цилиндров показана на рисунке 1.8. Процедура измерения параметровАЭ практически одинакова для всех коммерческих агрегометров.
Цельная кровь (илисуспензия клеток в растворе макромолекул) помещается в специальную кювету, иэритроциты полностью дезагрегируются путем приложения большого сдвиговогонапряжения. Затем сдвиговое напряжение снимается, и эритроциты начинаютспонтанно агрегировать, по изменению интенсивности рассеянного света определяетсявремя АЭ и общий уровень АЭ. Типичная кривая, по которой определяютсяпараметры, характеризующие АЭ, представлена на рисунке 1.9.24Анализируя временные зависимости интенсивности света, изображенные нарисунке 1.9, можно получать параметры, характеризующие кинетику агрегацииэритроцитов.Хотя с помощью разных приборов измеряются несколько разныепараметры, они имеют близкий физический смысл и являются сравнимыми. Болееподробному описанию способа измерений и сравнению параметров посвященаспециальная работа[99].
Упомянутые выше агрегометры измеряют следующиепараметры:Рис. 1.8. Упрощенная схема агрегометра. Компоненты установки: 1 – лазер, излучающий свет вкрасной или ближней ИК области спектра; 2 – фотодетектор, регистрирующий интенсивностьсвета, рассеянного назад эритроцитами, находящимися в зазоре между стаканами; 3 - двасоосных цилиндрических оптически прозрачных стакана с зазором около 1 мм; 4 – шаговыйдвигатель, вращающий внешний стакан, 5 – компьютер. Вращение внешнего стакана создает взазоре Куэттовский поток, в котором все эритроциты суспензии подвергаются одинаковомусдвиговому напряжению.1) Myrenne: индексы агрегации эритроцитов - M, M1, определяемые как площадьпод кривой через 10 секунд после снятия сдвигового напряжения и при изменении егона малое сдвиговое напряжение (3 с-1), соответственно.2) LORCA(Laser-assistedOpticalRotationalCellAnalyzer):максимальнаяинтенсивность (AMP); время достижения половины максимальной интенсивности25(T1/2); площадь над и под кривой после 10 секунд от снятия сдвигового напряжения;индекс агрегации (AI), определяемый как AI =AA+Bx100 (рисунок 1.9 б).3) RheoScan - измеряемые параметры такие же, как в агрегометре LORCA.Отличие состоит только в том, что измеряется интенсивность не обратно рассеянного,а проходящего сквозь образец света; соответственно AI =BA+Bx100 (см.
рисунок 1.9 а).Рис. 1.9. Кривые интенсивности рассеянного света, получаемые при измерении агрегацииэритроцитов по (a) прямо и (б) обратно рассеянному свету. Наблюдается изменениеинтенсивности света, по которому можно определять кинетику АЭ [5].4) Помимо перечисленных выше параметров RheoScan и LORCA позволяютизмерять динамическую характеристику АЭ [86,101]. Измерения происходят путемприложения к суспензии агрегированных эритроцитов, помещенной в линейныймикроканал, быстро спадающего сдвигового напряжения, как показано на рисунке1.10. В определенный момент создаваемого сдвигового напряжения становитсянедостаточно для удержания эритроцитов от спонтанной агрегации (либо дляразрушения агрегатов эритроцитов) и наблюдается изменение интенсивности света вобратную сторону.
Точка перегиба и есть минимальное сдвиговое напряжение,необходимое для разрушения агрегатов и/или удержания эритроцитов от агрегации,26которое названо критическим сдвиговым напряжением (critical shear stress – CSS) вслучае агрегометра RheoScan или пороговым сдвиговым напряжением (threshold shearstress – TSS) в случае агрегометра LORCA. В силу отличий способа приложениясдвигового напряжения в агрегометре RheoScan (тонкий плоский проточный канал) и вагрегометре LORCA (вращающиеся соосные стаканы) CSS < TSS примерно в два раза[86].Рис.
1.10. Измерение критического сдвигового напряжения (τc, CSS) с помощью агрегометраRheoScan. Сдвигвое напряжение в точке перегиба на временной зависимости интенсивностирассеянного света соответствует CSS [86].1.3.2 Методы и результаты изучения агрегации эритроцитов на уровнеиндивидуальных клетокНесмотря на распространенность и удобства методов агрегометрии цельнойкрови, их сложно применять для изучения фундаментальных механизмов АЭ. Дляэтого используют такие методы, как аспирация микропипетками (АМ) [102], лазерныйпинцет (ЛП) [103], атомно силовая микроскопия (АСМ) [104], сканирующий27электронный микроскоп (СЭМ) [89] и другие [105], которые позволяют проводитьизмерения на уровне индивидуальных клеток. При этом большинство работ посвященоизучению взаимодействия эритроцитов в индуцирующих АЭ растворах декстрана.Рис.
1.11. СЭМ-изображения агрегатов эритроцитов (а,б); зависимость межклеточногорасстояния между агрегированными эритроцитами в зависимости от молекулярной массы иконцентрации декстрана, измеренная с помощью СЭМ (в-г) [89]. Видно, что межклеточноерасстояние зависит только от размера макромолекул и не зависит от концентрации.Наиболее подробное изучение механизмов взаимодействия эритроцитов былосделано в пионерских работах, выполненных с использованием методов АМ [106-108]и СЭМ[109-111].
В этих работах были получены первые оценки энергиивзаимодействия эритроцитов и предложены гипотезы о соответствующих механизмах.Подробнее механизмы взаимодействия эритроцитов описаны в параграфе 1.4. Здесь мырассмотрим ключевые результаты, полученные с применением этих методов, которыенеобходимы для дальнейшей дискуссии.28МетодомСЭМбылиполученыследующиерезультаты:измеренымежклеточные расстояния при АЭ в растворах декстрана, как показано на рисунке1.11. Расстояние между эритроцитами не зависит от концентрации, но только отразмеров (молекулярной массы) декстрана.
При этом расстояние между клеткамивсегда больше, чем характерная длина макромолекул декстрана [89]. Удалениеповерхностного заряда эритроцита с помощью нейраминидазы практически неизменяло межклеточное расстояние.Рис. 1.12. (а) Измерение энергии взаимодействия эритроцитов при их агрегации методомаспирации микропипетками в различных растворах.
Энергия взаимодействия рассчитываетсяпо конечной деформации эритроцита, используя известные параметры жесткости клетки.Наблюдается колоколообразная зависимость от концентрации декстрана. Энергиявзаимодействия эритроцитов значительно увеличивается при удалении поверхностного заряда(остатков сиаловых кислот) с помощью нейраминидазы. (б-в) процедура измерения:эритроциты (сфероцит и дискоцит) подводятся друг к другу до контакта и удерживаются; поистечении времени от нескольких секунд до минут эритроциты спонтанно перекрываются[102,112].Несмотря на это, как показали измерения, проведенные с помощью АМ,взаимодействие эритроцитов значительно усиливается в отсутствии поверхностногозаряда (рис.
1.12) [88,102,112]. Методом АМ была измерена энергия взаимодействия29эритроцитов, как показано на рисунке 1.12. Характерные значения плотности энергиисоставили порядка нескольких мкДж/м2. Оценка энергии взаимодействия получаласьиз анализа кинетики самопроизвольного «наползания» эритроцитов друг на друга идеформации эритроцита, исходя из известного коэффициента жесткости мембраны[112,113]. Наблюдалась колоколообразная зависимость энергии взаимодействияэритроцитов от концентрации декстрана.Рисунок 1.13.
Пример сильной точечной связи между эритроцитами при их дезагрегации врастворе декстрана, наблюдается в экспериментах методом аспирации микропипетками [112].Методом АМ были выполнены эксперименты по разделению агрегата,состоящего из двух эритроцитов, в растворе декстрана. В работе [112] было показано,что для разделения клеток требуется приложить значительно большую силу посравнению с той, что измеряется при их спонтанной агрегации, хотя количественныеданные не приводились. Наблюдался точечный трудно разрываемый контакт междуэритроцитами (рис.
1.13). После разрушения этого контакта эритроциты уже спонтанноне агрегировали. Таким образом указывалось, что агрегация и дезагрегация в растворенейтральных макромолекул не есть взаимно-обратный процесс [112]. Правда неисключено, что подобное сильное взаимодействие не является агрегационным, а есть30результат слияния участков мембран - то, что в литературе называют “тетер (tether)”[114,115].Рис.
1.14. Измерения энергии взаимодействия эритроцитов с помощью АСМ. (а) схемаэксперимента. Два эритроцита прикрепляются к кантилеверу и к поверхности кюветысоответственно; один эритроцит подводится с помощью кантилевера и прижимается к другомуэритроциту, находящемуся на поверхности; далее эритроциты разделяются передвижениемкантилевера с известной жесткостью. (б) плотность энергии взаимодействия, измеренная длядекстранов 70 кДа и 150 кДа, в зависимости от их концентрации. Непрерывные кривыепостроены по теоретическим расчетам, выполненным по модели обедненного слоя (см.
глава1) [104].Позже измерения, проведенные с помощью АСМ (рис. 1.14), [104,116] показаликорреляцию энергии взаимодействия эритроцитов при дезагрегации клеток с той, чтоизмерялась в процессе спонтанной агрегации с помощью АМ. (Ввиду спецификиизмерений с помощью АСМ, САЭ не измерялась). При этом колоколообразнаязависимость от концентрации макромолекул также наблюдалась и в экспериментах,проводившихся с помощью АСМ.
Эти результаты показывают, что известные излитературы данные о характере САЭ и ДАЭ в растворах нейтральных макромолекулразличны даже для исследований на уровне индивидуальных клеток.31При измерениях методами АСМ и МА не учитывалась динамика процесса ввидуспецифики методов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
