Диссертация (1102496), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Разные измеренияпоказаны соответствующими цветами.67Заключение по главе 3В данной главе изложены экспериментальные результаты исследованиявзаимодействия эритроцитов при их агрегации в различных средах, индуцирующихагрегацию клеток. Показано значительное отличие процесса спонтанной агрегацииэритроцитов от процесса дезагрегации эритроцитов.
Сделано сравнение параметров,которое необходимо для рассуждения об механизмах взаимодействия эритроцитов.Результаты измерений на уровне индивидуальных клеток сравнены с измерениями нацельной крови, найдена хорошая корреляция результатов. Показано, что известныекоммерческие агрегометры способны измерять параметры только САЭ, но не ДАЭ.68Глава 4. Механизм взаимодействия эритроцитов при ихагрегацииДанная глава посвящена оценке энергии взаимодействия эритроцитов при ихспонтанной агрегации и дезагрегации и развитию представлении о биофизическихмоделях, адекватно описывающих механизм взаимодействия эритроцитов.
Показано,что взаимодействие эритроцитов в растворах нейтральных макромолекул адекватноописывается в рамках представлений, приведенных в литературе. Напротив,взаимодействие эритроцитов в плазме противоречит им. Предлагается расширеннаямодель «подвижных мостиков», адекватно описывающая взаимодействие эритроцитовпри их дезагрегации в плазме, сыворотке и растворах белков плазмы. Комбинациямоделей «обедненного слоя» и «подвижных мостиков» предлагается для описаниявсего процесса обратимой агрегации эритроцитов в плазме.Зачем это нужно?Моделивзаимодействияэритроцитов,представленныевлитературе,сталкиваются с трудностями при интерпретации экспериментальных данных.
Случайпропорциональности силы взаимодействия и площади взаимодействия эритроцитовможет описываться обеими моделями: для модели «мостиков» плотность точексвязывания макромолекул пропорциональна площади взаимодействия эритроцитов;для модели «обедненного слоя» осмотические силы пропорциональны площадиобразованного обедненного слоя. В то же время увеличение силы дезагрегации приуменьшенииплощади взаимодействия эритроцитов не может бытьимеющимися моделями.описаноТаким образом, необходимо усовершенствовать моделиописывающие механизмы взаимодействия эритроцитов.
В данной главе сделанаколичественная оценка энергии взаимодействия на базе измерении сил взаимодействияпри САЭ и ДАЭ. Полученные данные сравнены с существующими моделями69взаимодействия эритроцитов, приведена дискуссия по возможному способу описаниявзаимодействия эритроцитов.В частности, для описания ДАЭ в плазме и растворах белков мы использовалимодель «подвижных мостиков», использованную уже в литературе для описаниявзаимодействий лейкоцита с мишенью [142] и при агглютинация эритроцитов [143].Следует отметить, что агглютинационные взаимодействия эритроцитов примерно на 2порядка сильнее, чем агрегационные. Модель «подвижных мостиков» может считатьсярасширенной моделью «мостиков», и здесь мы кратко опишем ее перед тем, какперейти к описанию наших результатов.4.1. Модель «подвижных мостиков»Общие сведения о моделиМодель «подвижных мостиков», используемая в нашей работе изначально быларазработана для описания взаимодействия лейкоцитов с мишенью [142].
Авторымодели исследовали зависимость энергии взаимодействия (E) лейкоцита и мишени подинамике разделения лейкоцита и мишени с помощью метода АМ. Способ измеренияЕ включал множество этапов, учитывающих жесткость клетки и ее деформацию,локальноеприложениедавлениямикропипетками.Здесьмыэтоподробнорассматривать не будем. Важно, что по мере разделения этих клеток наблюдалосьзначительное увеличение E, что сопоставимо с ДАЭ в плазме и растворах белков (рис.3.5, гл. 3). Такой характер взаимодействия описывался моделью «подвижныхмостиков»: увеличение E по мере уменьшения площади взаимодействия клетокобъясняется тем, что «мостики» могут перемещаться по мембране клетки, и по мересмещения клеток относительно друг друга «мостики» могут стягиваться, а также могутобразовываться новые «мостики».
В итоге Е увеличивается, если стягивание иобразование «мостиков» преобладает над их разрушением. Была получена формула, по70которой рассчитывается Е для данной модели. Здесь мы приведем только её конечныйвид (способ выведения этой формулы описан подробно в работе [142]:E 2 kT m 0 b / [1 b ( S i / S 0 )](5)Здесь E – энергия взаимодействия эритроцитов, – площадь взаимодействияэритроцитов, 0 – начальная площадь взаимодействия клеток, 0 – начальнаяплотность «мостиков» до адзегии, b – безразмерный параметр прочности «мостика», k– коэффициент Больцмана, T – абсолютная температура.
Параметры b, 0 получаютсячисленными методами, а остальные параметры могут быть непосредственно измерены.4.2 Оценка энергии взаимодействия эритроцитов с помощью лазерногопинцетаРасчет энергии взаимодействияОценка энергии взаимодействия эритроцитов по измерениям ЛП проводиласьследующимобразом.Рассматривалосьизмерениесилывзаимодействия,представленное в главе 3 на рисунке 3.5. Мы имеем параметры: F – силавзаимодействия эритроцитов и ∆A – относительное линейное смещение эритроцита.Для вычисления работы использовалась простая механическая модель, представленнаяна рисунке 4.1 (а).
Работа для передвижения эритроцита (U) получалась как U = F ✕∆A. Такой подход был возможен в виду того, что измерялись минимальные силы,характеризующие ДАЭ. Работа, затрачиваемая для разделения пары эритроцитов,рассчитывалась поэтапно, для каждых FD и ∆A, как показано на рисунке 4.1 (б). Дляполного разделения эритроцитов в плазме затрачивалась энергия U = 148 ± 49 аДж.Расчет плотности энергии взаимодействия эритроцитовПлотность энергии взаимодействия эритроцитов (E, мкДж/мкм2) была полученакак отношение работы к площади взаимодействия эритроцитов.
Была рассчитана E дляпроцесса ДАЭ в плазме и в растворе декстрана (рисунок 4.2). Хорошо видно, что в71растворе декстрана E остается постоянной, а плазме, напротив, E возрастает по мереразделения клеток.Рис. 4.1. (а) Схема оценки работы на дезагрегацию эритроцитов. Крестиками отмеченыположения ЛП, стрелка обозначает направление движения эритроцита по мере дезагрегации. (б)Работа, затрачиваемая для дезагрегации эритроцитов в плазме.Зависимость, наблюдаемая для ДАЭ в плазме, похожа на ту, которая имеетместо в модели «подвижных мостиков». Получая параметры b и m0 численнымметодом и рассчитывая энергию взаимодействия по формуле 4.1, мы наблюдаемвысокуюкорреляциюэкспериментальныхрезультатов(рис.4.2)смоделью«подвижных мостиков».
Основание использования модели «подвижных мостиков» дляописания взаимодействия эритроцитов в плазме, следующее: (1) белки, в частности,фибриноген могут связываться специфически и неспецифически с мембранойэритроцита; (2) мембрана эритроцита является подвижной; (3) практически всеэлементы мембраны эритроцитов могут перемещаться. Из этого следует, чтоподвижность точек связывания вполне может иметь место при взаимодействииэритроцитов. При этом эффект возрастания силы, наблюдаемый при ДАЭ, объясним72аккумуляцией «мостиков».
Экспериментальные факты, полученные в данной работе,также служат дополнительными аргументами в пользу использования данной моделидля описания взаимодействия эритроцитов.Рис. 4.2. Зависимости энергии взаимодействия эритроцитов при их дезагрегации ототносительного смещения эритроцитов. Теоретические зависимости для плазмы – модель«подвижных мостиков», для декстрана – модель «обедненного слоя».Аргументы такие: (1) Зависимости сил взаимодействия эритроцитов при ихдезагрегации (а следовательно и энергии их взаимодействия) в растворе белков(фибриногена с альбумином) и в плазме совпадают, как можно видеть из рис.
3.5. Приэтом в растворе белков САЭ отсутствует. Это согласуется с литературными данными.В отсутствии сторонних сил мембраны эритроцитов не могут приблизиться достаточноблизко, чтобы образовать «мостик». Мы показываем, что эритроциты в растворахбелков действительно спонтанно не агрегируют, но будучи приведенными в контактдруг с другом, они прочно связываются. Следует отметить, что взаимодействие,73наблюдаемоеврастворебелков,труднопредставитьрезультатомдействияосмотических сил, т.к.
механизм «обедненного слоя» исключает возможностьотсутствия САЭ. Таким образом, экспериментальные результаты подтверждают рольфибриногена с альбумином в качестве «мостиков», удерживающих агрегат.(2) Сравнение сил в плазме и сыворотке крови (рис. 3.2), показываютзначительную роль фибриногена в САЭ, но только в комплексе с другимикомпонентами плазмы. Можно предположить, что осмотические силы проявляются вкомплексе с другими компонентами крови и фактически являются силами,приближающими эритроциты достаточно близко, чтобы образовывались «мостики»,которые в свою очередь крепко удерживают агрегат.(3) Энергия взаимодействия клеток в растворе декстрана коррелирует созначением по модели «обедненного слоя» (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
