Диссертация (1102344), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Для сравнения с данными компьютерногомоделирования требовался чистый водный раствор мономеров лизоцима безкаких-либо примесей.В ходе работы был проведен анализ чистой воды из ряда лабораторийМГУидругихинститутов.Наиболеечистойбылапризнанадистиллированная деионизованная вода промышленной очистки, из которойприготовлялся бидистиллят. Полученная вода при высыхании не оставлялазагрязнений, имела нейтральный рН и нулевую ионную силу.Лизоцим практически нерастворим в чистой воде, он образует растворполимеров с характерным диаметром 40-60 нм.
Растворимость лизоцимаможно повысить увеличением ионной силы, однако в присутствии ионов98возрастает скорость его димеризации. Был разработан следующий способполучениямономеровлизоцима.Водныйрастворкристаллическоголизоцима помещался на 10 часов в термостат с температурой 45° С(температура обратимой денатурации лизоцима – 63° С), после чегополученный раствор помещался в центрифугу на 10 минут при скорости14 500 оборотов в минуту. В результате в верхней части пробирки получалсячистый раствор мономеров и димеров лизоцима.Процесс симуляции адсорбции выбранного полимера на созданнуюподложку можно разбить на следующие стадии:1)Объединение подложки, белка pdb-банка [143] имолекул воды в единую систему, путем помещения в кубик 100200 Å белка и подложки на достаточном удалении (40-50 Å) изаполнении кубика молекулами воды, пересчитанными изконцентрацийиплотностирастворенныхвеществирастворителя.2)Молекулярно-динамическая симуляция кубика, какнезамкнутой, но периодичной системы (продолженной в себя):расчет сил в силовом поле и перемещение в направлении сил(Рисунок 3.11).
Времена симуляции - 10-20 нс или меньше, дофакта адсорбции(стабильном удержании атомов белка нарасстоянии менее 5-8 ангстрем от подложки)3)Оценка адекватности результатов- анализ явныхартефактов (белок пронзил подложку, вода испарилась доадсорбции, подложка изогнулась, белок денатурировал (выходгидрофобного ядра белка в растворитель), белок растянулся из-запериодичности кубика и сорбировался на обе стороны).Исправление ошибок в силовом поле, повлекших за собойнеадекватное моделирование.99Рисунок 3.11 Симуляция адсорбции белка лизоцима на кварцевую подложкуПолученнаяадсорбированноговрезультатебиополимерасимуляциииспользуетсяконечнаявконформацияследующеймоделизондового сканирования.В работе впервые была построена модель зондового сканирования.Существуют работы по моделированию кантилеверов для атомно-силовоймикроскопии с целью их калибровки [141], однако построенные моделинеприменимыдляполучениямодельныхАСМ-изображений.Схемамоделирования следующая:1) выбор группы пробных атомов, моделирующих кончик зонда, схарактерным радиусом Ван-дер-Ваальса;2) выбор на поверхности сетки с определенным шагом по осям XY;3) выполнение в каждом узле сетки следующей операции: группапробных атомов перемещается по оси Z, в каждой точкесчитаетсярасстояниямоделирующейзонд,отцентрадоцентровсферыВан-дер-Ваальса,сферВан-дер-Ваальсаближайших атомов.
Регистрируется точка с максимальным100значением Z, в которой происходит перекрывание этих сфер(Рисунок 3.12). Массив таких точек представляет собой сеточнуюдвумерную функцию Z(x,y) и записывается в файл.Рисунок 3.12 Моделирование зондового сканированияПолученная двумерная функция – это идеальное АСМ-изображение(Рисунок 3.13). При его получении не учитываются броуновское движениеатомов, конформационная подвижность белка, деформация вследствиевзаимодействия с зондом.Рисунок 3.13 Визуализация данных моделируемого сканированияАлгоритм сравнения выглядит следующим образом.101На модельном изображении выделяется изображение белка. Для этоговыбираетсяпороговоезначение ,соответствующеемаксимальномузначению высоты подложки. Все точки, высота которых превосходит этопороговое значение, считаются принадлежащими белку.У полученногобелка численно вычисляются его характерный размер, максимальноезначение высоты−, площадь его проекции на ось (x, y), а так же егообъем как поверхностный интеграл ∫( ( , ) −), вычисляемый поплощади белка на изображении.На экспериментальном изображении выделить белок не так просто всвязи с наличием шумов.
Для решения этой задачи предварительнопроизводится фильтрация изображения для ослабления шумов (взвешенноеусреднение). Затем подбирается пороговое значениетаким образом, чтобыточки, в которых значения высоты превышают пороговое,образовывалисвязанную ограниченную область максимального размера.
Таким образом,данное значениесчитается максимальным значением зашумленногозаднего плана. Для полученной области аналогично определяются те жепараметры – характерный размер, максимальное значение высоты, площадьпроекции на ось (x, y), объем. В этом случае высота белка в каждой точкеопределяется относительно среднего значения заднего плана: ℎ =−(+)/2.Послепримененияалгоритмастановитсявозможнымсравнитьмодельное изображение белка с его предполагаемым изображением наэкспериментальном снимке по полученным параметрам и принять решение отом, присутствует ли на изображении белок и насколько качественнополученное изображение.Был проведен ряд экспериментов по адсорбции мономерного водногораствора лизоцима на слюду при разных значениях времени адсорбции (от 5минут до 40 часов) и разных концентрациях (от 0,05 мкг/мл до 10 мг/мл).102Наиболее подходящие параметры для получения изображений мономеров –концентрация лизоцима 0,05мкг/мл и время сорбции 20 мин.
Для точногоразрешения структуры белка использовался ультраострый кантилевер срадиусом закругления 1нм. В результате получены следующие данные(Рисунок 3.14)Рисунок 3.14 Данные атомно-силовой микроскопии лизоцима, концентрация лизоцима в воде0,05мкг/млНа данном изображении видно присутствие фонового шума, которыйсильно затрудняет обработку данных, однако от него невозможно избавиться.Средняя высота объектов на изображении составляет 0,5 нм. Эта высотасильно занижена по сравнению с ожидаемой (1,7 нм по данным АСМэкспериментов[145]) вследствие деформации белка кантилевером.Также следует отметить, что лизоцим имеет тенденцию собираться вмонослои после сорбции на поверхность.
Это явление наблюдалось приболеевысокихконцентрациях,чемнаприведенномизображении.Замеченный эффект согласуется с экспериментальными данными другихисследователей [146-148].Для дальнейшей обработки полученного изображения, на немвыделялись области с отдельным белком (Рисунок 3.15) размером 10х10 нм,103которые потом сравнивались с аналогичными изображениями, полученнымикомпьютерным моделированием.Рисунок 3.15 АСМ-изображение единичного лизоцимаКомпьютерные модели строились в программе NAMD, выбор которойобусловлен тем, что она является одной из самых популярных и доступныхдляиспользованиянапараллельныхвычислительныхкомплексах.Симуляции проводились на кластерах факультета ВМиК МГУ и НИВЦ МГУ.Поскольку в эксперименте использовался кристаллический лизоцим,была взята кристаллическая PDB-структура лизоцима 1iee, полученнаяметодами рентгеноструктурного анализа.Подложка, моделирующая слюду, представляла собой кристаллическийоксид кремния с расстоянием между атомами кремния и кислорода 1,6 Å вквадратной элементарной ячейке, заряды атомов составляли +1,11е и -0,66есоответственно.
Подложка имела размеры 100х100х10 Å. Поверхностьподложки состояла из гидроксидов, расположенных под углом 45° кповерхности. Белок помещался в водяной кубик размерами 100х100х200Ǻ,располагающийся на подложке и состоящий из отдельных молекул воды. Всимуляции были выбраны периодические границы, то есть система104продолжалась сама в себя. Поэтому лизоцим, изначально помещенный всередину водяного куба, перед началом симуляции смещался в сторонуподложки до расстояния в 40-50 Ǻ, чтобы избежать попадания в состояниеустойчивого равновесия между подложкой и ее периодическим повтором.Проводились также симуляции с другими параметрами границ, однакоописанная выше модель оказалась наиболее адекватной.
Если по одному изнаправлений убрать периодические границы, система находилась в условиях,аналогичных нахождению в вакууме и вода начинала испаряться. Если несмещать белок по вертикали, адсорбции не происходило. Если же высотуводяного куба сделать небольшой (порядка 100Ǻ), наблюдалась адсорбциябелка сразу на 2 поверхности, конформация сильно изменялась.Симуляция проводилась при рН 7.0, нулевой ионной силе, до тех пор,пока не была зарегистрирована устойчивая адсорбция (рисунок 3.16), послеРисунок 3.16 Конечная конформация адсорбированного лизоцима10 нс моделирования.Полученная конформация использовалась дляпостроения модели зондового сканирования.В качестве пробного зонда были выбраны 8 атомов кремния –минимальнаягруппаатомов,подчиняющаясяВан-дер-Ваальсовувзаимодействию.
Радиус Ван-дер-Ваальса этой группы составил 4 Ǻ. Шаг105решетки, в узлах которой проводился замер по высоте составлял 0,3Ǻ. Врезультате было получено следующее изображение (Рисунок 3.17) :Рисунок 3.17 Визуализация данных моделирования зондового сканированияПолученныереальноеимодельноеизображениясравнивались.Изначально предполагалось считать корреляцию между двумя двумернымифункциями, представляющими собой поверхности.
Предполагалось находитьтакое взаимное расположение поверхностей, при котором коэффициенткорреляции был бы максимален, после чего считать среднеквадратичноерасстояние между узлами функций. Экспериментальные данные показали,что высоты сравниваемых объектов отличаются довольно сильно, поэтомунеправомерно использовать корреляционный анализ. Взамен был предложенспособ сравнения по форме и объему исследуемых объектов, описанныйвыше.3.4.2 Результаты и обсуждение.После применения алгоритма становилось возможным сравнитьмодельное изображение белка с его предполагаемым изображением наэкспериментальном снимке по полученным параметрам и принять решение,присутствует ли на изображении белок и насколько качественно полученноеизображение.
Данные для сравнения представлены в таблице 3.5.106Таблица 3.5.Сравнение экспериментальных и модельных данныхНаименованиехарактеристикиОбразец Образец Образец Образец ОбразецМодель№1№2№3№4№5размер, Å45..5055..7062..6689..9774..8293..98Площадь, Å2170031603370658037706620Объем, Å338800215001934061300159206198034.03831422740ХарактерныйМаксимальнаявысота , ÅКак видно из таблицы 3.5, данные реального и компьютерногоэкспериментасущественноразличаются.Эторазличиевызванозашумленностью АСМ изображения и сильной деформацией белка впроцессе сканирования. Существуют работы, в которых показано, что белкимассой меньше 30 кДа не могут быть адекватно визуализированы в зондовоймикроскопии[149],посколькуискажаетсясоответствиемеждувертикальными и горизонтальными размерами белка, объем изображения несоответствует объему реального объекта.
Так же, по данным атомно-силовоймикроскопии[148-150], лизоцим при агрегации на отрицательно заряженнуюповерхность не сохраняет свою изначальную форму, а как бы расползаетсяпо поверхности, чтобы увеличить площадь контакта. В симуляции же видно,что конечная конформация (рисунок 3.16) имеет большие размеры, чемначальная (рисунок 3.11). Возможное объяснение этому состоит в том, чтоначальная структура белка получена методами рентгеноструктурногоанализа, то есть в кристаллической форме, поэтому белок плотно упакован.Можно предположить, что в растворе сначала идет процесс разворачиваниябелка, а затем уже агрегации. Полученные в настоящем исследовании107результаты позволяют предположить, что процесс агрегации длительный, изанимает времена большие, чем характерные времена симуляции, поэтому наданном этапе эксперимента учесть этот процесс не представляетсявозможным.Для решения возникшей проблемы планируется улучшить модельзондового сканирования, в которой предполагается учесть инерционностькантилевера в процессе колебаний[151].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
