Диссертация (1102344), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Для концентрации ионов NaCl 20мМ иMgCl2 5мМ персистентная длина составляла 22.6±1.1 нм. Такой характерзависимости персистентной длины от ионной силы типичен для заряженныхполимеров, у которых вклад электростатики в персистентную длинуобусловлен эффектом Дебаевского экранирования и зависит от ионной силыследующим образом[120]:Pel~Is-n/2(3.3)Процесс моделирования полимеризации выбранного белка можноразбить на следующие стадии:oПодготовка системы. Выбор структуры из pdb-банкаструктур, расположение белков относительно друг друга на требуемомрасстоянии(обычнопорядкахарактерногоразмерамолекулы)построение топологии белков, добавление воды и ионов.
Взаимноерасположение белков имеет несколько вариантов, чтобы рассмотретьвсе возможные варианты димеризации.oМолекулярно-динамическаясимуляциясистемыспериодическими границами. Времена симуляции - 50-100 нс илименьше, до факта димеризации (стабильном удержании белков рядомдруг с другом, образование водородных связей)83oОценкаадекватностирезультатов-анализявныхартефактов (белок денатурировал, белки разошлись в растворителе,слишком быстрое движение белков друг к другу). Исправление ошибокв силовом поле, повлекших за собой неадекватное моделирование.oАнализполученнойконформацииипоисксайтовсвязывания.
Сравнение сайтов связывания разных вариантов системы(разных вариантов взаимного расположения белков)oДобавление к системе еще одной молекулы сигма-субъединицы и получение тримеров, и т.д.Для получения димеров σ70-субъединицы было составлено 6 вариантоввзаимного расположения молекул, проводилось моделирование каждого изних в течение 40 нс (См. Таблицу 3.1).Димеризация возникла только в двух случаях, условно называемыхвзаимодействием NCR и "клешней" (см.
Рис 3.2) .Для дальнейшегоисследования был выбран вариант с наибольшим количеством контактов(Рис.3.3), а именно взаимодействие NCR.Таблица 3.1.Начальные и конечные конформации сигма-субъединиц для димеризацииСистемыНачальное положениеКонечное положениеОбластиконтактаМономер имономер,взаимодействиеклешней477GLU - 581ASP482GLU - 567MET484ALA - 555GLUМономер имономер,взаимодействиеклешни и NCR536THR - 10LYS,11VAL, 14THR606VAL - 53ILE84Мономер имономер,взаимодействиеклешней451ARG – 606VAL,605GLU452ILE – 606VAL499LYS – 522PHEМономер имономер,взаимодействиеNCR306PHE – 318ALA,319ALA, 321ALA309ASN, 310GLY –319ALA309ASN – 322MET316PHE – 321ALA,322MET315TRP – 322MET,323ASNМономер имономер, нетвзаимодествияНадо сразу же отметить, что все варианты взаимодействия димеровдруг с другом или димеров с мономерами происходили за счетвзаимодействия клешней, реализуя второй вариант димеризации.Рисунок 3.3 Димер сигма-субъединицы, полученный после 40 нс моделирования в воде сконцентрацией ионов NaCl 20мМ и MgCl2 5мМБыло построено 4 варианта расположения двух димеров друг относительнодруга и 3 варианта взаимного расположения мономера и димера (Таблица3.2).
Минимальное расстояние между молекулами имело диапазон 3-7 нм.85Таблица 3.2.Начальные и конечные конформации сигма-субъединиц для полимеризацииСистемыНачальное положениеКонечное положениеОбластивзаимодействияДимер имономер149ASP – 471LEU,475GLY, 476ARG150ARG,151VAL –475GLY, 476ARG213ASP, 214PRO –489MET, 490PRO,491GLY467SER – 520GLYДимер имономер24TYR, 25ALA – 443ILE,444ALA,445ASP,446GLN26GLU, 28ASN, 29ASP –44ALA, 443ILE34ASP – 475GLY35ILE – 472GLN36VAL – 468ARGДимер имономерДимер идимер104GLU – 397ARG,398GLY, 399LEU105MET – 398GLY,399LEU,448ARG, 449THR106GLY – 448ARG, 449THR,503GLU, 504PRO, 505ILE107THR – 504PRO, 505ILE110LEU – 497VAL, 500ILE11LEU – 533ASP112THR – 532LEU, 535 ALA404LEU – 451ARG, 452ILE408GLY – 452ILEДимер идимерДимер идимер86609SER –574GLU,575GLU,576VAL607LEU – 574GLUДимер идимерПеред началом моделирования мономер моделировался в течение100нс, а димер в течение 40 нс.
Моделирование димеров с димерами идимеров с мономерами длилось 70 нс.Вовсехтрехвариантахсистемдимер-мономернаблюдалосьвзаимодействие клешней, в случае систем димер-димер два вариантапоказали взаимодействие клешней (Рис.3.4), в двух других случаях никакоговзаимодействия не наблюдалось. Следует отметить, что в случае системдимер-димер наблюдалась закрученность получаемого полимера, он не былпрямым, причем угол между димерами медленно увеличивался со временем,а глобулы, образованные хвостами белков, были повернуты друготносительно друга на угол примерно в 90°, т.е. имела местосуперспирализацияполибелковойцепи[118].Рисунок 3.4 фибрилла σ70-субъединицы, образованная из двух димеров после 70 нс моделирования вводе с концентрацией ионов NaCl 20мМ и MgCl2 5мМ87Такая структура очень напоминает полученные в эксперименте in vitroбусины на нити в червеобразных структурах(см Рис.
3.4). Было выдвинутопредположение, что в дальнейшем полученная нить суперспирализуется собразованием жестких палочек, хорошо видных в эксперименте.Таким образом, были выяснены предполагаемые места связываниямолекул при димеризации.Всего было получено 6 вариантов контактов : один вариантвзаимодействия NCRобластей, и 5 вариантов взаимодействия «клешней».При этом в трех случаях N-концы взаимодействовали с С-концами, а в двухС-концы взаимодействовали с С-концами. В одном из вариантов фибриллы,полученной из двух димеров, структура располагалась в одной плоскости,что позволило вычислить ее персистентную длину. Для длины фибриллы в40 нм и угла между димерами в 81° она составила 20 нм.
Размеры димерабыли следующие: 20 нм в длину, 4 нм в ширину и 6.8 нм в высоту.Результаты сравнения данных АСМ и молекулярной динамики представленыв Таблице 3.3.Таблица 3.3.Результаты сравнения размеров фибрилл σ70-субъединицы, полученныхметодами АСМ и молекулярной динамикиВысота «бусин нанити», нмРасстояние между«бусинами», нмПерсистентнаядлина, нмЧервеобразныеструктуры вАСМ4.2±0.615-2022.6±1.1Моделирование6.8-3.9~2120В целом данные демонстрируют хорошее соответствие, различаясьпримерно на 20%.
Разница в размерах «бусины» вызвана, в первую очередь,искажением латеральных и вертикальных размеров белка во время88сканирования АСМ. Однако, уширение изображения за счет кончикакантилевера не влияет на полученные данные о расстоянии между«бусинами» и персистентную длину. В связи с хорошим соответствиемданных АСМ и МД, можно предположить, что «бусины» сформированыглобулойиздвухNCRдоменовσ70-субъединицыполимеризациисоседнихбудетбелков,выглядетьтогдамодельследующимобразом(Рис.3.5).Рисунок 3.5 Модель фибриллообразованияДанная работа поддержана грантами РФФИ 15-32-20629 Атомносиловая микроскопия конвергентных транскрипционных комплексов и 13-0401504 Исследование механизмов образования амилоидных нанофибрилл сиспользованием бактериальных систем.3.2.2ВыводыС помощью молекулярной динамики были выяснены предполагаемыеместа связывания молекул при димеризации и предложена модельобразования фибрилл σ70-субъединицы РНК полимеразы кишечной палочки.3.3Исследование адсорбции фибриногена намодифицированные поверхности слюды и графита.Изучение адсорбции белков на различные твердые поверхности имееткак практическое значение (создание материалов для имплантатов), так инаучное (изучение свойств белков и изменения их функций при адсорбции).89На сегодняшний день экспериментально адсорбция одиночных белков можетбыть изучена только с помощью атомно-силовой микроскопии.
Однакокачество данных оставляет желать лучшего, разрешения этого методанедостаточнодляполученияколичественныхданныхоструктуреадсорбированных белков. Моделирование процесса адсорбции белков в техже условиях, что и в эксперименте, может открыть новые областиприменения АСМ в биологии.В данной работе был выбран для изучения белок фибриноген.Молекула фибриногена представляет собой димер массой 340 кДа, каждаясубъединица которого состоит из трех полипептидных цепей, αА, βВ, γсоединенных дисульфидными связями в единую структуру (Рис. 3.6).Фибриноген имеет три глобулярных домена, соединенных между собойтройными альфа-спиралями: центральный Е домен, образованный из Nконцов цепей, и С-концевые D домены.
αС концы цепей αА выходят из Dдоменов, они практически неупорядочены, поэтому полностью структурабелка в РСА не получена.Рисунок 3.6 Структура кристаллического фибриногена, данные РСАαС-цепииграютважнуюрольвлатеральнойагрегацииприполимеризации фибрина[122]. Они участвуют в процессе межмолекулярноговзаимодействия и превращения фибриногена в фибрин[123]. Посколькуфибриноген - один из важнейших белков в процессе свертывания крови,изучение конформационных преобразований молекулы имеет большуюнаучную ценность. Отдельные молекулы фибриногена хорошо изучены вэлектронной микроскопии [124-126] и АСМ [127-129], были получены четкие90изображенияединичныхмолекулнагидрофобных(HMDS-модифицированная слюда, графит) и гидрофильных (слюда, Graphite Modifier(GM))поверхностях [130-133]. Различия в структуре белка очень велики (смРис 3.7), однако, несмотря на общую тенденцию, в литературе идут споры охарактере взаимодействия белка с подложками, о том, какие именно частибелка участвуют во взаимодействии в зависимости от гидрофобностиподложки.Рисунок 3.7 Фибриноген на слюде (А), ), модифицированой HMDS слюде (Б),модифицированном GMграфите (В) и графите (Д) по данным АСМНапример, существуют две гипотезы о расположении αС-цепейфибриногена на слюде: между белком и поверхностью и над белком.
Только91методом атомно-силовой микроскопии эти гипотезы не могут бытьподтверждены или опровергнуты, поэтому было предложено провестимоделирование адсорбции фибриногена на подложки графит, графитмодифицированныйGM,слюду,ислюду,модифицированнуюгексаметилдисилозаном.3.3.1Материалы и методыМоделирование проводилось в среде Gromacs, версия 4.6.5 а такжеNAMD 2.8. Использовались силовые поля AMBER99sb-ildn и CHARMM27 cдополнительной параметризацией для атомов подложек. Все вариантысистем белков окружались водно-солевым раствором, модель воды TIP3P, сконцентрацией NaCl 15мМ. Радиус обрезания кулоновских ивандерваальсовых сил составлял 1.2 нм.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
