Особенности микробной трансформации азота в кишечнике термитов и в термитниках (1098315), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Определение эммссмм метана Для определения интенсивности метаногенеза образцы почвы и материала термитника (5 г) помещали в пенициллиновые флаконы, герметично за- 1'оличекхла И. л Огонь инпгши .иннин и< я тронсф грюпции их ига а киша'чиии~ >трнитнс а а тч~ иили~игао крывали их, замещали воздух аргоном и инкубировали в термостате при 28'С в течение 5 суток, после чего измеряли содержание метана в газовой фазе. При измерении эмиссии метана у живых термитов и в лепках навески составляли от 0,2 г до 1 г.
Анаэробных условий при этом не создавали и инкубировали пробы в течение 1 часа. Измерения проводили на газовом хроматографе СЬгопз-41 (производство Чехословакия) с пламенно-ионизационным детектором, длина колонок 3,2 м, внутренний диаметр 2 мм, наполнитель сферосил, расход газа-носителя 30 млlмин, объем вводимой пробы 1 мл (Ножевникова и др., 1999). Определение ннтенснвностн дыхания (змнсснн СОз) Для измерения эмиссии утлекислого газа из почвы и из материала термитников навески (2 г) исследуемых субстратов помещали в герметично закрывающийся флакон (15 мл) и инкубировали в термостате в течение суток.
Определение концентрации СОз в газовой фазе проводили на хроматографе Московского опытного завода «Хроматограф» (модель 3700/4) с детектором по теплопроводности, наполнитель колонок — Полисорб-2, скорость потока газа — носителя (гелий) — 30 млlмин, температура катарометра 100'С, измерительных элементов 150'С, объем вводимой пробы 0,5 мл. Определение содержания азота Определение содержания азота в образцах почвы и термитника, привезенных из Туркмении, проводили методом Къельдаля на приборе К1е11ес-1002 (производство Швеция, Хеса1ог) и на НСИ-анализаторе. Определеннесодержання углерода Содержание углерода определяли в образцах серозема и термитника из Туркмении.
Определение содержания углерода проводили методом сухого 1'о»арче««оа .Ч. д Ог~««'«иос опг ~шлу«юнн» тронсф у:«7»«и а««ои ««иш«ч««««««р«анне и «тп1««тникик сжигания в токе кислорода на экспресс-анализаторе АН-7529 с кулонометрическим окончанием (Республика Беларусь, г. Гродно, завод измерительных приборов, ГОСТ 22261-76). Выделение чистых культур микроорганизмов Чистые культуры микроорганизмов выделяли из термитов № сазгапеия, лабораторных «ленок» зтих термитов, а также из образцов, привезенных из Туркмении, — почвы и материала термитника А.
аЬщейапию. Для выделения бактерий из «ленок» лабораторных термитов, образцов серозема и материала термитника А. айщелапиз приготавливали серию стандартных разведений, из которых производили посев на питательные среды. Для выделения бактерий из термитов их взвешивали и стерилизовали с поверхности спиртом, после чего из брюшек термитов приготовляли суспензню, которую разводили стандартным образом и производили посев на твердые и жидкие питательные среды из 11 и П1 разведений.
Для выделения, учета и культивирования бактерий использовали твердую глюкозо-пептонно-дрожжевую среду (ГПД): Составглюкозо-пептонно- ожжевойс е ы г/л Пептон. СаСОз. дрожжевой экстракт .. .20 агар. глюкоза.. Для выделения и культивирования чистых культур азотфиксирующнх микроорганизмов использовали среду Эшби следующего состава: .20 ... 21 агар. 45 Гааичеаиае Гяини инисн~н инни~бина трансфариаяии аизта ~ ы в. кишечнике терииннт и и т~ риитнинии .0,2 К2НРО4. Ма$04 ИаС! .0,2 КН2РО4 .0,1 СаСОз. Кроме того, в отдельных случаях нами использовались дополнительно среды Федорова — Калининской и МПА: Состав ы Фе о рва в Калининской гlл: 15 — 20 г ....10 — 15 г Агар Глюкоза ... К2НРО4 ..0,91 г МйЮ х7Н О...
СаС!~ибН20""" ....0,3 г ......0,1 г ИаС1 ,0,5 г РеС1зибН2О --. .. следы дрожжевой автолизат.............. 100 мг 4 Для культивирования микроорганизмов в микроазробных условиях чашки с твердой средой помещали в анаэростат. При помощи вакуумного насоса из анаэростата откачивали воздух и заполняли азотом. Идентификацию выделенных культур проводили на основании микроморфологических и физиолого-биохимических признаков, руководствуясь определителем Берджи (Определитель бактерий Берджн, 1997). Более точную идентификацию проводили с использованием автоматизированной системы для идентификации микроорганизмов %1е1с-60 (пр-во ВюМегецх). Видовая принадлежность в данной системе устанавливалась по 30-32 основным биохимическим тестам.
В случае необходимости использовали 5-6 дополнительных тестов. 1ъличеикоа лх л Опмн ннт пи~ 1ялчнп яс й трпчс~ пу ло1ри слэйда сю кашс чнике ннрчиги и; и ю т у> иипииплт Изучение некоторых свойств азотфиксаторов методом спектроскопии нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) В настоящей работе впервые предпринята попытка применить метод спектроскопии нарушенного полного внутреннего отражения прн изучении феномена азотфиксации у азотфиксирующих культур микроорганизмов, выделенных из пищеварительного тракта термитов № сазйкеия. Основные положения метода детально изложены в работах 1О.Н.
Королева (Королев, 1973; Королев, Телегин, Бирюков, 1973; Королев, Телегин, 1973; Богданов, Королев и др., 1974; Королев и др., 1974; Королев и др., 1979; Никитина, Королев, Телегин, 1987; Королев, Рыжкова, Бурлаков, 1998; Королев, 1998; Малахов, Королев, 1998) В основе метода лежит феномен нарушенного полного внутреннего отражения — это явление возникает в результате отражения света от объекта (среды), частично поглощающего электромагнитное излучение.
Таким образом, при нарушенном полном внутреннем отражении происходят потери энергии излучения. Если же объект не поглощает свет, то при переходе света из оптически более плотной среды (например, измерительный элемент) в оптически менее плотную среду (например, изучаемый объект) при углах, больших критического, наблюдается явление полного внугреннего отражения (Королев, 1973). Связь между упюм падения и углом преломления световой волны, попадающей на границу раздела двух сред с различными показателями преломления, описывается законом Снеллиуса: и, япО=л, япф „„, О- угол падения светового луча; Е- угол преломления светового луча; 1'олмченкоа ЛХ!5. Ослик мнт ~ли чшк~мзьн<а трам /юрмо1ума ыситюа а юиигчнллтс нл рпимлн; и а лспо нита ил их п1 — показатель преломления первой среды; пр.
— показатель преломления второй среды. Критическим углом называется такой угол падения, при котором пре- ломленный луч совпадает с границей раздела сред. В конце 50-х годов ХХ века Фаренфордом было показано, что луч света отражается не с поверхности среды, а заходит в нее на некоторую глубину с(р. Нр=Л, /2л(зп1 Π— г©"',„ п2~=п2/пн пз — показатель преломления объекта исследования; п~ — показатель преломления измерительного злемента (оптически бо- лес плотной среды). 1ч — длина волны в измерительном злементе. Изменение любого из зтих параметров или их сочетаний позволяет из'ба менять глубину проникновения светового луча в объект.
Отсюда становится понятным, почему метод НПВО позволяет, в частности, изучать объект по слоям (Королев, 1973). В качестве измерительных злементов нами использовались кристалл германия (бе) и Иртран-2 (УпБ). В представленной ниже таблице приводятся численные значения п1 и 9 для примененных нами измерительных злементов. Таблица ГоиичсинччаМ В. Осооч нноч нчи ччи Чттичи тчитчсфорччоции ин ти и кнш»чнии» ни оччичнчт и н нч нч чччтччччн:ич Так как требуется иметь данные о химическом составе клеток и о степени пространственной организации биополимеров, мы воспользовались методом спектрального анализа в инфракрасном диапазоне.
Исключительно сложный коллоид, каким является цитоплазма микроорганизма, содержит большое число веществ, в той или иной степени поглощающих инфракрасные лучи. Для каждого из них характерны свои полосы поглощения в тех или иных участках спектра. Сливаясь, полосы поглощения различных веществ дают бедный деталями спектр, в котором четко выделяется лишь определенное число полос, общих для большинства составных частей клетки. ° 2800 — 3000 см ': 2970 — полоса антисимметричных валентных колебаний СН в СНЗ-группе; ° 2930 — полоса антисимметричных валентных колебаний СН в СН2- группе; ° 2870 — полоса симметричных колебаний СН в СНз-группе; ° 2850 — полоса симметричных колебаний СН в СН2-группе. ° 1500 — 1800 см ': 1730 — 1740 — полоса смещенных валентных колебаний в неионизированной карбоксильной группе и зфирах; ° 1650 — 1660 — или АМИД-1 — полоса, главным образом, валентных колебаний С=О в пептидной группе; т 1450 — 1550 — или АМИД-2 — полоса, главным образом, смешанных деформационных колебаний И вЂ” Н и валентных колебаний С вЂ” И и С=О в пептидной группе.
° 1400 — 1500 см: 1450 — полоса антисимметричных деформационных колебаний С-СНз. Кроме того, валентные колебания Х вЂ” Н связи дают сильную полосу около 3300 см '. 49 1 0.7 Ф Ч Р М А О 6 .М. в. осяипнос тн накрлйной трл>к4 гюлции ал лм и кишечнике тертюн«м~ в в тдчситии:ш Изучение ориентации отдельных компонентов микроорганизмов на поверхности измерительных элементов может быть выполнена путем анализа интенсивности полос поглощения в спектре НПВО, полученном при разной поляризации плоскополяризованного света для какого-нибудь из углов падения О.
Наиболее удобно выполнить этот анализ для О = 45'(Королев, 1973). Метод был применен на культуре бацилл ВасИ1ия йсйеп~~олии. Штамм был выделен из термитов Ф. сазгалеия и из гнездового материала. Культура являлась активным азотфиксатором (максимум азотфиксирующей активности этой культуры, измеренной в анаэробных условиях, приходился на четвертые сугки) и хорошо росла на безазотистых средах, даже после многочисленных пересевов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
