Диссертация (Атипичный красный плоский лишай кожи и слизистой оболочки рта клиника, диагностика, дифференциальная диагностика, совершенствование методов лечения), страница 10

После чего в течение10 минут, исследуемый материал промывался в изотоническом растворе хлориданатрия с фосфатным буфером (pH 7,0-7,4) для удаления не связанных с тканямирастворимых белков. Затем исследуемый препарат обрабатываелся люминесцентной сывороткой(вкачествеметкидляантителиспользова-ли флюоресцеина изотиоцианат) против Ig основных классов (G, M, A,) и С3компонента комплемента на протяжении 30 минут, вновь промывался в течение10 минут в изотоническом растворе хлорида натрия с фосфатным буфером, и помещался в 60% нейтральный глицерин под покровное стекло.

В глицерин добавлялся кристаллик парафенилендиамина для предохранения препарата от выгорания в люминесцентном микроскопе.Для контроля в световом микроскопе одновременно проводилось изучениекриостатных срезов, окрашенных гематоксилином и эозином.522.2.5. Определение поверхностных дифференцировочных антигенов и адгезивных молекул на клетках периферической кровиметодом проточной цитофлюорометрииВзятие венозной крови проводилось в стерильные пробирки с раствором гепарина (500 ед./мл). Гепаринизированная кровь разводилась в 2 раза средой 199 инаносилась на Ficoll-Paque (Pharmacia, Sweden) в соотношении 3 объема лейкоцитарной массы на 1 объем фиколла, а затем центрифугировалась при комнатнойтемпературе при 1,5 тыс оборотов в мин на протяжении 45 минут. Мононуклеарные клетки собирали из интерфазы при помощи пастеровской или автоматической пипетки.

Клетки отмывали при комнатной температуре первый раз в среде199 в течение 20 минут при 1500 оборотах в минуту, а затем еще 2 раза по 10 минут при 1000 оборотах в минуту. Подсчет клеток проводился в камере Горяева.Для иммунофенотипирования клеток применялась широкая панель моноклональных антител серии ICO (НПЦ «МедБиоСпектр», Россия).В реакции непрямой поверхностной иммунофлюоресценции проводиласьпроточная цитофлюорометрия. Для этого 5105 отмытых в PBS (фосфатносолевой буфер) клеток в объеме 50 мкл инкубировались с 20 мкл МКА (моноклональные антитела) при комнатной температуре в течение 30 минут.

После однократной отмывки в PBS центрифугированием в течение 7 минут при 1500 об/мин,клетки инкубировались при 4С в течение 30 минут с 20 мкл с меченной FITC(флуоресцеина изотиоцианат) антисывороткой барана против иммуноглобулиновбелой мыши (НПЦ «МедБиоСпектр», Россия). Затем клетки дважды отмывались иресуспендировались в PBS, содержащем 1% формалин и 0,1% азид натрия. Экспрессия антигенов на лимфоцитах определялась на проточном цитофлюориметреFACScan (Becton Dickinson) с использованием панели моноклональных антител(BeckmanCoulter) с реактогенной направленностью против большого спектрадифференцировочных антигенов и маркеров активации: CD3+, CD4+, CD8+,CD16+, CD11b+, HLA-DR+, CD25+, CD38+.

В каждой пробе анализировали от5000 до 10000 событий в зависимости от цели исследования. Для анализа экспрессии антигенов на определенных популяциях клеток (лимфоциты, моноциты,53нейтрофилы) устанавливались «окна дискриминации» или гейты, которые соответствовали определенным физическим параметрам. За экспрессию маркера принимались клетки с интенсивным сигналом флюоресценции выше порогового значения.2.2.6. Метод экстракорпоральной фотохимиотерапииМатериально-техническое обеспечение метода1.

ОблучателькровиэкстракорпоральныйОКУФКЭ-320/400-600/650-01«ЮЛИЯ». Производитель ЗАО НПКФ «МЕТОМ». Регистрационное удостоверение Минздрава России №29/01040502/4362-02 от 25.09.2002 г.2. Аппарат для цитоплазмафереза MCS+. Производитель HEAMONETICS CORPORATION, США. Регистрационное удостоверение ФС № 2005/119 от28.01.20053. Контейнер для крови и ее компонентов полимерный однократного примененияТУ 64-2-361-85. Рег. №86/1027-12-14. Фотосенсибилизирующий препарат: Аммифурин, регистрационный номер: ЛС002598, от 2011-10-26Описание методаС помощью клеточного сепаратора «HAEMONETICS MCS+» (USA) по протоколу RBCP (выделение стволовых клеток) производилось выделение мононуклеарных клеток.

За одну процедуру из 450,0 мл крови выделялось около 25 млконцентрата мононуклеарных клеток, которые затем ресуспендировались в 0,9%растворе хлористого натрия, общий объем доводился до 200,0 мл. После этогоклеточная суспензия подвергалась ультрафиолетовому воздействию на аппаратеУФ облучения (УФО) «ЮЛИЯ» с λ 380-420 нм. Общая доза экспозиции составляла 0,8-1,2 Дж/см2. Фотосенсибилизатор- аммифурин, применялся в дозе 0,6 мг/кг.Препарат применялся внутрь за 2 часа до проведения процедуры.

После воздействия УФО, клеточная суспензия реинфузировалась пациенту в течение 30 минут[29]. Процедуру проводили через 1-2 дня, на курс 4 сеанса.54При комбинированном лечении с применением ЭФХТ и метотрексата после второй процедуры ЭФХТ производилась внутримышечная инъекция метотрексата в дозе 10,0 мг, после чего проводились еще 2 процедуры ЭФХТ.Низкая доза метотрексата, по данным Е.Л.Насонова, обеспечивает выраженный противовоспалительный и иммуномодулирующий эффект препарата [32].Все пациенты III группы были проконсультированы онкологом и по результату консультации им был назначен метотрексат.

Терапия с применением метотрексата не проводилась пациентам с алкогольной зависимостью и хроническойпеченочной недостаточностью, а также, в связи с подтвержденным тератогеннымэффектом метотрексата [175], ее не получали беременные, а также фертильные,планирующие беременность женщины.2.2.7. Методы статистической обработки полученных результатовДля описания количественных данных рассчитывали средние арифметические значения и стандартные отклонения (M±SD) либо медианы и квартили (Me[LQ; UQ]), если распределение переменной отличалось от нормального. Нормальность распределения проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Для анализавзаимосвязи двух количественных переменных проводили анализ с использованием коэффициента корреляции Спирмена (с расчетом статистической значимости различий коэффициентов между группами).

Сравнение количественных переменных в двух группах проводили с использованием критерия Стьюдента иликритерия Манна-Уитни (при невозможности использования критерия Стьюдентавследствие отсутствия равенства дисперсий анализируемых выборок, в случае отличия распределений переменных от нормального). Анализ динамических изменений переменных внутри групп анализировали с помощью критерия Стьюдентадля зависимых выборок или критерия Вилкоксона.

Для оценки различий одновременно между тремя выборками был использован критерий Крускала-Уоллиса(с апостериорными попарными сравнениями критерием Данна с поправкой намножественные сравнения) и точный критерий Фишера с дальнейшими апостериорными попарными сравнениями с поправкой Бонферрони. Сравнение коэффици-55ентов корреляции проводили с помощью модуля «Difference tests» (программаStatistica 13.2). Полученные различия считались статистически значимыми призначениях p <0,05.

Анализ проводился с использованием программ Statistica 13.2(Dell inc., USA), Microsoft Excel 2016 (Microsoft corp., USA).56РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙГЛАВА IIIЧАСТОТА И КЛИНИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АТИПИЧНЫХ ФОРМКРАСНОГО ПЛОСКОГО ЛИШАЯ КОЖИ И СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕКНами проведено обследование и ретроспективное изучение историй болезни97 больных аКПЛ- жителей Москвы и Московской области, находившихся на стационарном лечении в отделении дерматовенерологии и дерматоонкологии ГБУЗМО МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского в период с 2005 по 2017 гг. Среди них было 42 (43,3%) мужчины и 55 (56,7%) женщин в возрасте от 17 до 85 (в среднем 51 ±13,5) лет со сроком болезни от 1,5 месяцев до 40 лет (1 год [6 месяцев; 3 года], которая в 45 (46,4%) случаях имела рецидивирующее течение.В 81 (83,5%) случае процесс был представлен аКПЛ кожи (в том числе с поражением слизистой оболочки полости рта (СОПР) и половых органов; диагнозбыл подтвержден методом гистологического исследования очага поражения в 57случаях, методом ПИФ видимо здоровой кожи -в 36 случаях) и в 16 (16,5%) случаях- изолированным аКПЛ СОПР.

Ассоциация аКПЛ кожи с поражением СОПРбыла в 45 (55,6%) случаях, в 10 (22,2%) случаях это был тКПЛ СОПР, а в 35(77,8%) аКПЛ СОПР. В 19 (23,5%) случаях аКПЛ ассоциировался с КПЛ слизистых оболочек половых органов: в 12 (63,2%)-с типичной сетчатой формой и в 7(36,8%) - с атипичной.аКПЛ кожи был представлен гипертрофической формой в 31 (38,3%) случаях, пигментной в 23 (28,4%), атрофической в 11 (13,6%), фолликулярной- в 8(9,9%), усеченной в 3 (3,7%); буллезной в 1 (1,2%); эритематозной в 1 (1,2%) случаях. ВГС был диагностирован в 2 (2,5%), синдром Гриншпана-Потекаева- в 1(1,2%) случае.

Ассоциация аКПЛ кожи с аКПЛ СОПР была в 35 (43,2%) случаях.Последний был представлен гиперкератотической – в 17 (48,6%) случаях, эрозивно-язвенной – в 11 (31,4%), экссудативно-гиперемической –в 7 (20%) формами.Ассоциация аКПЛ кожи с аКПЛ половых органов была в 7 (8,6%) случаях, в 6(85,7%) с эрозивно-язвенной формой и в 1 (14,3%)с гипертрофической.57Изолированный аКПЛ СОПР был у 16 (16,5%) больных и был представлен:в 6 (37,5%) случаях экссудативно-гиперемической, в 5 (31,25%) эрозивноязвенной и в 5 (31,25%) гиперкератотической формами.

Более подробные данныеоб указанных ассоциациях представлены в табл.8.Таблица 8.Клинические формы атипичного КПЛ кожи и слизистой оболочки полости ртаФорма на слизистойГиперкератоЭрозивноЭкссудатитвноИтого пораполости рта Сетчатаятическаяязвеннаягиперемическаяжений кожи:Форма на кожеВсего (81)101711745Пигментная (23)262313Гипертрофическая (31) *3102217Атрофическая (13) **514212Фолликулярная (9) †33Эритематозная (1)Буллезная (1)Усеченная (3)*В том числе 1 случай синдрома перекрытия гипертрофического красного плоского лишая и дискоидной краснойволчанки**В том числе 1 случай вульвовагинально-гингивального синдрома и один случай синдрома Гриншпана Потекаева†В том числе один случай вульвовагинально-гингивального синдромаТаким образом, аКПЛ СОПР был у 51 (52,6%) из 97 больных аКПЛ.