Диссертация (Антибластомная активность и безопасность 4-алкил-замещенного производного аминохромена), страница 11

При введении внутрибрюшинно крысам веществоотносится к V классу токсичности (практически нетоксично).69ГЛАВА 4.ПРОТИВООПУХОЛЕВОЕ ДЕЙСТВИЕ 4-АЛКИЛ-ЗАМЕЩЕННОГОСОЕДИНЕНИЯ АМИНОХРОМЕНА АХ-5544.1 Определение эффективных противоопухолевых доз и концентрацийпроизводного хромена АХ-554Эффективную дозу вещества определяли на сингенной опухолевой модели – карциноме легкого Lewis (LLC)из банка опухолевых штаммов ФГБУ«Национальный исследовательский медицинский центр онкологии им. Н.Н.Блохина» Минздрава России.

Модель воспроизводили трехступенчатой перевивкой клеток опухолевого штамма [7]. Эффективную дозу находили в соответствие с международными рекомендациями [8].Эффективные концентрации фармацевтической субстанции АХ-554определяли в культуре клеток LLC при 72 часовой инкубации в среде с добавлением АХ-554 в диапазоне концентраций от 10-9 до 10-3 М на основе анализа содержания ЛДГ в среде культивирования методом количественногоИФА с использованием исследовательского диагностического набора ЛДГ-2производства«Ольвекс Диагностикум» (Россия).Статистическую обработку полученных результатов проводили методами вариационной статистики с использованием дисперсионного и пробитанализа [9].

Использовали пакет программ по статистике SPSS.Для определения диапазона эффективных противоопухолевых доз АХ554 были использованы дозы, составляющие 0,25%, 0,5%, 1%, 2,5%, 5%,7,5% и 10% от показателя ЛД50, определенного при внутрижелудочном введении мышам. Поскольку это значение составляет выше 5000 мг/кг, то расчетвели от показателя, равного 5000 мг/кг.На основе анализа противоопухолевой активности субстанции АХ-554 в экспериментальной опухолевой системе in vivo с помощью анализа кривой доза – эффект (рис. 4.9) с помощью интерфейса «Биостат» рассчитали показатели ЭД20, ЭД50 и ЭД90. При вычисле70нии соотношения между соответствующими летальными и эффективнымидозами были определены численные значения терапевтических индексов(ТИ).При вычислении эффективных доз фармацевтической субстанции АХ554 ЭД20 составила 21,2 мг/кг, ЭД50 составила 137,6 мг/кг, в то время какЭД90 равнялась 384,0 мг/кг.ТРО, %120100969580786059494023201201060110160210260310360410460Доза, мг/кгРисунок 4.9 – Кривая «доза – эффект» (по значению индекса ТРО на 7 суткипосле завершения внутрижелудочного введения АХ-554 в диапазоне доз от0,25 до 10% от ЛД50 мышам-самцамC57Bl/6 с LLCСледовательно, для дальнейшего доклинического исследования специфической противоопухолевой активности и механизмов антибластомногодействиянеобходимоиспользоватьследующиедозы:минимально-действующая – 21,2 мг/кг, средне-терапевтическая – 137,6 мг/кг и высшая терапевтическая – 384,0 мг/кг.

Поскольку доза 384 мг/кг соответствует 7,68%от показателя ЛД50, определенного для данного пути введения у мышей, онасоответствует условиям, согласно которым высшая терапевтическая доза недолжна превышать 10% от показателя ЛД50 [112].71При расчете терапевтических индексов (ТИ20, ТИ50или ТИ90 как соотношение соответствующей летальной и эффективной доз) нами были получены следующие показатели: 94,3; 36,3 и 23,4 соответственно (рис. 4.10). Наосновании полученных данных можно судить о широте терапевтическогодействия исследуемого соединения: в частности, значение высшей терапевтической дозы в 18 раз превышает показатель минимально-действующей дозы.Отношение соответствующих значений ЛД и ЕД100908070605040302010094,336,323,4Терапевтический индексТИ20ТИ50ТИ90Рисунок 4.10 – Значения терапевтических индексов (ТИ) на 7 сутки послезавершения внутрижелудочного введении АХ-554 в диапазоне доз от 0,25%до 10% от ЛД50 мышам C57Bl/6 с LLCИсследование эффективных концентраций фармацевтической субстанцииАХ-554 определено в культуре клеток карциномы легкого A549/ATCCпри их инкубировании в среде с добавлением фармацевтической субстанцииАХ-554 в семи концентрациях: 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 М.

По результатам invitro исследований были вычислены показателиЭК20, ЭК50иЭК90– расчетные концентрации, вызывающие гибель 20%, 50% и 90% клеточной популяции в культуре соответственно (рис. 4.11, 4.12).72Таким образом, диапазон эффективных цитотоксических концентрацийв отношении опухолевых клеток карциномы легкого A549/ATCC находится впределах от 10-9 до 10-4 М, при этом средняя эффективная концентрация составляет 2х10-7 М, что сопоставимо с концентрациями фармацевтическойсубстанции вещества в плазме крови и легочной ткани при её внутрижелудочном введении нелинейным мышам в ЕД20, ЕД50 и ЕД90 и внутривенномвведении в ЕД50 в рамках проведения фармакокинетических исследованийфармацевтической субстанции.% гибели клеток в культуре1009080706050403020100-9-8-7-6-5-4-3-2Рисунок 4.11 – Кривая «концентрация – эффект» (по значению % гибеликлеток культуры LLC при ее 24-часовом инкубировании с фармацевтическойсубстанцией АХ-554 в диапазоне концентраций от 10-9 до 10-3 М (по оси абсцисс – степень концентрации в М)При вычислении показателей ЭК20, ЭК50и ЭК90 нами были получены следующие результаты (рис.

4.12): 10-8, 2х10-7 и 10-4 М.Полученные результаты свидетельствуют о том, что исследуемое вещество в виде фармацевтической субстанции обладает оптимальным профи73лем безопасности, характеризующимся крайне низкой острой токсичностью,большой широтой терапевтического действия и высокой противоопухолевойактивностью в отношении сингенной опухоли легких мышей.0,000120,00010,00010,000080,000060,000040,000022E-071E-090Эффективные концентрацииЭК20ЭК50ЭК90Рисунок 4.12 – Значения показателей эффективных концентраций фармацевтической субстанции АХ-554, определенных по цитотоксическому действиюв культуре A549/ATCC4.2 Противоопухолевое и антиметастатическое действие АХ-554 на модели сингенной гетеротопической опухоли мышей –карциномы легкого LewisПротивоопухолевую активность оценивали по ингибированию ростаопухоли при внутрижелудочном введении фармацевтической субстанции иреферентных противобластомных лекарственных средств в трех дозах – минимально-действующей, средне-терапевтической и высшей терапевтической(табл.

4.18) у 10 животных из каждой серии, отобранных случайным образомиз общей группы, получающей специфическое лечение, состоящей из 20 животных.74В контрольной группе животных подкожная сингенная опухоль достигала на 1 сутки после отмены внутрижелудочного введения физиологического 0,9% раствора хлорида натрия в среднем 932 мм3, на 7 сутки – 4142мм3, а на 21 сутки наблюдения – 8887 мм3. Вес солидной опухоли, полученной у выведенных из эксперимента животных на 22 сутки после прекращения введения плацебо, равнялся 9,30,6 г. Индекс торможения роста опухоли(ТРО) составил 0% (табл.

4.18).Таблица 4.18 – Значения индекса ТРО для АХ-554 и референтных препаратов при внутрижелудочном введении мышам C57Bl6 с сингенной опухолью –карциномой легкого Lewis – на 1, 7 и 14 сутки после прекращения леченияТРО, %№ се-ИсследуемоеДоза,риивеществомг/кг/сут1 сутки7 сутки14 сутки1Контроль-00060,2342029113,3513553166,46262644,54132505,35758536,077797721,2353746137,6646866384,0707475234ДоксорубицинЦисплатинАХ-554Референтный противоопухолевый антибиотик доксорубицин изучен втрех дозах. Лишь в высшей терапевтической дозе, составившей 166,4мг/кг/сутки, у препарата сохранялся эффект по подавлению роста сингенногорака легкого мыши более, чем на 50% на 7 сутки наблюдения и, таким образом, препарат сравнения оказывал умеренное антибластомное действие наисследуемой опухолевой системе. Однако, следует подчеркнуть, что проти75воопухолевое действие препарата усиливалось к 14 суткам после его отмены,поскольку наблюдали повышение индекса ТРО по сравнению с предыдущими значениями, рассчитанными для препарата.

В том числе, индекс превышал значение 50% как в серии животных, получавших ВТД препарата, так иСТД доксорубицина.Второй препарат сравнения цисплатин оказывал высокий противоопухолевый эффект в СТД и ВТД и умеренное противобластомное действиев МДД: его действие продолжалось во времени, о чем свидетельствовалопродолжающееся сокращение роста опухоли и уменьшение ее размеров присравнении с размерами, вычисленными на предыдущих точках измерения,что нашло свое отражение и в значении индекса ТРО (таблица 4.18). Препарат обладал также мощным антиметастатическим действием: в высшей терапевтической дозе частота метастазирования в серии составила лишь 30%(таблица 4.18).Исследуемая фармацевтическая субстанция АХ-554 при внутрижелудочном введении в трех исследуемых дозах также продемонстрировала наличие высокого противоопухолевого эффекта на сингенной опухолевой модели.При введении в течение 7 суток в минимально-действующей дозе 21,2 мг/кгиндекс ТРО на 7 сутки после прекращения лечения – наиболее чувствительный индикатор эффективности – составлял 37%.

Однако при увеличении дозы до средней терапевтической – 137,6 мг/кг/сутки значение индекса к 7 суткам составляло 68, а высшей терапевтической дозе – 74.Также для АХ-554 присуща закономерность, описанная для цисплатина, а именно сохраняющийся после отмены цитостатический эффект, проявляющийся в углублении противоопухолевой активности, и прогрессирующего уменьшения массы и объема опухоли.

Субстанция вещества в средней ивысшей терапевтических дозах оказывала заметное антиметастатическоедействие в виде снижения частоты метастазирования и среднего числа поверхностных метастазов.76При исследовании выживаемости животных проводили наблюдениеза оставшимися в каждой серии 10 животными, которых не выводили из эксперимента на 22 сутки после прекращения соответствующего вида лечения,до 90 суток (или гибели животного) (рис. 4.13).В контрольной группе животных начало гибели мышей регистрировали между 25 и 30 сутками, при этом наибольшая летальность отмечена между 55 и 70 сутками наблюдения, когда погибло 60% животных контрольнойгруппы.

Последняя мышь погибла на 58 сутки. В целом, выживаемость животных контрольной группы была выше, нежели продолжительность жизниживотных на модели сингенной опухоли. Средняя продолжительность жизниживотных контрольной группы составила 37 сут.1098Число животных7654321025354555657585Дни после отмены леченияКонтрольДоксорубицин МДДДоксорубицин СТДДоксорубицин ВТДЦисплатин МДДЦисплатин СТДЦисплатин ВТДАХ-554 МДДАХ-554 СТДАХ-554 ВТДИнтактныеРисунок 4.13– Кривая выживаемости животных через 21 день после отменыспецифической противоопухолевой терапии мышам с сингенной опухолью –карциномой легкого Lewis77Все исследуемые референтные противоопухолевые лекарственныесредства увеличивали продолжительность жизни экспериментальных иммунодефицитных мышей с сингенной опухолевой системной – гетеротопической карциномой легкого Lewis.

При этом наибольшая средняя продолжительность жизни отмечена в группе животных, получавших ВТД доксорубицина – 63 дней и ВТД цисплатина – 61 день.Фармацевтическая субстанция АХ-554 также увеличивала продолжительность жизни животных, причем в группе мышей, получавших СТД АХ554 средняя продолжительность жизни составила 53 дня, а у животных, получавших в течение 7 суток внутрижелудочно ВТД субстанции – 58 суток,что в последнем случае превышает продолжительность жизни мышей контрольной группы более, чем на 50%.При изучении частоты ремиссий и выздоровлений при использованиисубстанции вещества во всех изученных дозах, ремиссии опухоли и выздоровлений животных не наблюдали.Таким образом, подводя итог данному разделу работы, необходимо отметить, что в диапазоне доз от 21,2 до 384 мг/кг и концентраций от 10-9 до 104М АХ-554 подавляет соответственно рост опухоли в модельной системе умышей и вызывает гибель злокачественных клеток карциномы легкого Lewisв опытах invitro от 20% до 90%.Высшая терапевтическая доза АХ-554 превышает минимально действующую более, чем в 18 раз, что свидетельствует о большой широте терапевтического действия вещества.78ГЛАВА 5.ИЗУЧЕНИЕ АЛЛЕРГИЗИРУЮЩЕГО И ИММУНОТОКСИЧЕСКОГОДЕЙСТВИЯ ВЕЩЕСТВА АХ-5545.1 Изучение аллергизирующего действия АХ-554Основная задача изучения аллергизирующих свойств состоит в том,чтобы в эксперименте на животных доказать или исключить возможностьразвития в организме состояния повышенной чувствительности (сенсибилизации) к лекарственномувеществу АХ-554 с противоопухолевой активностьюили его метаболитам.Выбор тест-систем, используемых в исследовании, определялся требованиями, изложенными в фундаментальном «Руководстве по проведениюдоклинических исследований лекарственных средств» и международнойпрактикой генотоксикологических исследований (см.