Диссертация (Антибластомная активность и безопасность 4-алкил-замещенного производного аминохромена), страница 12

гл. 2). Тесты являютсянаиболее верифицированными и широко используемыми в экспертных и научных исследованиях генотоксичности синтетических и природных соединений. Исследование включало в себя изучение аллергизирующих свойств лекарственного вещества на морских свинках и мышах.При этом, оценка аллергизирующего действия фармацевтической субстанции АХ-554 проводилась с использованием следующих моделей и методов: оценка анафилактогенной активности на морских свинках; реакция общей системной анафилаксии, реакция активной кожной анафилаксии; реакция гиперчувствительности немедленного типа (ГНТ) и реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) на морских свинках при эпикутанномнанесении вещества; реакция гиперчувствительности немедленного типа(ГНТ) и реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) на морскихсвинках при конъюнктивальном нанесении вещества; реакция гиперчувствительности замедленного типа на мышах; тесты in vitro на модели реакцииГЗТ у морских свинок при внутрикожном введении субстанции: реакция79специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ), определение количества эозинофилов, влияние на фагоцитарную активность нейтрофилов (НСТ-тест).5.1.1 Изучение аллергизирующего действия АХ-554 в тестах in vivoВнутрисердечное введение на 17-й день опыта разрешающих доз фармацевтической субстанции АХ-554 морским свинкам, ранее сенсибилизированным АХ-554, и контрольным морским свинкам не вызвало анафилактического шока.

Индекс по Weigle в этих группах равен 0 (табл. 5.19).Таблица 5.19 – Реакция общей системной анафилаксии при тестированиифармацевтической субстанции АХ-554 и овальбумина на самцах морскихсвинок (n=6 в каждой группе)ГруппаСенсибилизирующаядозаРазрешающая дозаИндексWeigleКонтроль 1Физ.

растворАХ-554(55,0 мг/кг)0Контроль 2Физ. растворАХ-554(225,0 мг/кг)0Контроль 3Физ. растворАХ-554(550,0) мг/кг)0Контроль 4Физ. растворОвальбумин(120 мг/кг)0АХ-554АХ-554(8,5 мг/кг)(8,5 мг/кг)АХ-554(55,0 мг/кг)0АХ-554АХ-554(55,0 мг/кг)(55,0 мг/кг)АХ-554(225,0 мг/кг)0АХ-554АХ-554(153,6 мг/кг)(153,6 мг/кг)АХ-554(550,0 мг/кг)0ОвальбуминОвальбуминОвальбумин(40 мг/кг)(40 мг/кг)(120 мг/кг)4При внутрисердечном введении овальбумина иммунизированнымморским свинкам наблюдалась 100% гибель животных (индекс по Weigle ра80вен 4). Введение овальбумина контрольным морским свинкам симптомованафилаксии не вызвало.При изучении реакции активной кожной анафилаксии внутрикожноевведение интактным морским свинкам 20% раствора АХ-554 не вызывалореакции раздражения. Поэтому в качестве разрешающей дозы использовали20% раствор вещества.

Разрешающая концентрация овальбумина – 5% раствор, так как более высокие дозы вызывали покраснение в области инъекции.Результаты исследования изложены в табл. 5.20.Таблица 5.20 – Реакция активной кожной анафилаксии при введении 20%раствораАХ-554 и овальбумина (5% раствор) на самцах морских свинок(М±m, n=6 в каждой группе)ГруппаСенсибилизирующаядозаРазрешающая дозаРазмер пятна,ммАХ-554Контроль 1Физ. раствор(0,05 мл 20% раство-1,40±0,16ра)АХ-554АХ-554(225 мг/кг)(225 мг/кг)АХ-554АХ-554(550 мг/кг)(550 мг/кг)АХ-554(0,05 мл 20% раство-1,70±0,26ра)АХ-554(0,05 мл 20% раство-1,60±0,27ра)ОвальбуминКонтроль 2Физ. раствор(0,05 мл 20% раство-1,70±0,26ра)ОвальбуминОвальбуминОвальбумин(40 мг/кг)(40 мг/кг)(0,05 мл 5% раствора)9,1±0,38*Примечание: *- различия достоверны по сравнению с группой соответствующего контроля при р<0,05 (U-критерий Манна-Уитни).81Иммунизация АХ-554 по стандартной схеме не вызывала у морскихсвинок реакции активной кожной анафилаксии.

Диаметр синего пятна в месте внутрикожного введения разрешающей дозы изучаемого вещества АХ-554у животных опытных и контрольной групп не превышал 3 мм.Введение разрешающей дозы овальбумина вызывало статистическизначимое увеличение размера пятна. Размер пятна в контрольной группе, получавшей сенсибилизацию физ. раствором и провокацию овальбумином, составил в среднем 1,70±0,26, а в группе животных, сенсибилизированныховальбумином – 9,10±0,38 мм.В рамках настоящего раздела исследования также изучили реакциигиперчувствительности немедленного типа (ГНТ) и гиперчувствительностизамедленного типа (ГЗТ) на морских свинках при эпикутанном нанесенииАХ-554.При нанесении на кожу 0,2 г (максимально возможное количество наисследуемом участке кожи) 5% мази на вазелине АХ-554 каких-либо симптомов раздражения выявлено не было.

Было принято решение использоватьданную концентрацию мягкой лекарственной формы как разрешающую дозу.Разрешающая доза овальбумина – 10% мазь, так как мази в более высокойконцентрации вызывали покраснение в области нанесения.Нанесение разрешающей дозы – 0,2 г 5% мази соединения АХ-554 навыстриженный участок кожи спины морским свинкам на 12-е сутки послесенсибилизации пероральным введением в течение 10 дней в дозах 225 мг/кги 550 мг/кг, пропорциональных 5- и 10-кратным СТД, не приводило к возникновению кожных реакций гиперчувствительности замедленного и немедленного типа. Тестируемые участки кожи у животных данных опытныхгрупп через 15 минут, спустя 1, 4, 24 и 48 часов наблюдения после нанесенияразрешающей дозы не отличались от участков кожи контрольных животных(табл. 5.21).82Нанесение на кожу сенсибилизированных морских свинок овальбуминавызывает различной степени выраженности проявления аллергии – от слабого покраснения через 15 минут до отека кожи через 24 и 48 часов.Закапывание 2,5% раствора соединения АХ-554 в глаз под верхнее векоинтактным морским свинкам не вызывало реакции раздражения.

Поэтому вкачестве разрешающей дозы использовали 2,5% раствор исследуемого лекарственного средства. Разрешающая концентрация овальбумина – 5% раствор,так как растворы в более высокой концентрации вызывали покраснениеконъюнктивы.Таблица 5.21– Эпикутанная реакция при изучении АХ-554 (0,2 г в виде 5%мази) и овальбумина (0,2 г в виде 10% мази) на самцах морских свинок (вбаллах, M±m, n=6 в каждой группе)СенсибилизацияВремя после нанесения на кожу разрешающей дозыКонтрольАХ554АХ554Овальбумин(225 мг/кг)(550 мг/кг)(100 мг/кг)15 мин0,00±0,000,00±0,000,00±0,000,40±0,16*1 час0,00±0,000,00±0,000,00±0,001,70±0,15*4 часа0,00±0,000,00±0,000,00±0,002,20±0,13*24 часа0,00±0,000,00±0,000,00±0,002,70±0,21*48 часов0,00±0,000,00±0,000,00±0,003,30±0,26*Примечание: *- различия достоверны по сравнению с группой контроля прир<0,05 (U-критерий Манна-Уитни)Закапывание предварительно сенсибилизированным внутрижелудочным 10-дневным введением соединения АХ-554 в дозах 225 мг/кг и 550 мг/кгморским свинкам под верхнее веко правого глаза 1 капли 2,5% раствора (разрешающая доза) исследуемого лекарственного вещества, а под верхнее веколевого глаза 1 капли дистиллированной воды (растворитель) не приводило кизменению сосудистого рисунка конъюнктивы глаза через 15 минут, 24 и 4883часов наблюдения (0 баллов) (табл.

5.22). Таким образом, вещество АХ-554не вызывает реакции гиперчувствительности немедленного и замедленноготипа (ГНТ и ГЗТ).Таблица 5.22– Конъюнктивальная реакция при изучении ГНТна фоне введения АХ-554 (2,5% раствор) и овальбумина (5% раствор) на самцах морскихсвинок (в баллах, M±m, n=6 в каждой группе)СенсибилизацияВремя после нанесения на кожу разрешающейдозыКонтрольАХ554АХ554Овальбумин(225 мг/кг)(550 мг/кг)(100 мг/кг)15 мин0,00±0,000,00±0,000,00±0,000,50±0,17*24 часа0,00±0,000,00±0,000,00±0,001,40±0,16*48 часов0,00±0,000,00±0,000,00±0,002,30±0,20*Примечание: *- различия достоверны по сравнению с группой контроля при(р<0,05, U-критерий Манна-Уитни)Закапывание морским свинкам после сенсибилизации однократнымвнутримышечным введением овальбумина под верхнее веко правого глаза 1капли 5% раствора (разрешающая доза) овальбумина вызывала аллергические реакции разной степени выраженности – от легкого покраснения до покраснения всей конъюнктивы и склеры.Результаты исследования гиперчувствительности замедленного типа,представленные на рис.

5.14, свидетельствуют о том, что у нелинейных мышей соединение АХ-554 в концентрации 10 мМ в 50 мкл ПАФ не вызывалаувеличения отека правой лапы в сравнении с контрольной группой, т.е. невлияло на формирование реакций гиперчувствительности замедленного типа.Напротив, в контрольной группе животных введение овальбумина вконцентрации 100 мкг в 50 мкл ПАФ в подушечку правой задней лапы наблюдалось увеличение прироста отека, что свидетельствует об аллергическойреакции.84Таким образом, соединение АХ-554 в виде фармацевтической субстанции не обладает способностью вызывать аллергические реакции замедленного типа.129,64 *108,47 *Баллы8642,352,321,8722,270КонтрольАХ-554Через 6 часовОвальбуминЧерез 24 часаПримечание: *- различия достоверны по сравнению с группой контроля при(р<0,05, U-критерий Манна-Уитни)Рисунок 5.14 – Реакция гиперчувствительности замедленного типа у самцови самок мышей после введения ФС АХ554 и овальбумина (индекс реакции,%, M±m, n=10 в каждой группе)5.1.2 Изучение аллергизирующего действия АХ-554 в опытах in vitroВведение сенсибилизированным животным разрешающей дозы овальбумина (позитивный контроль) вызывало статистически значимое увеличение лизированных лейкоцитов, что подтверждает способность овальбуминавызывать аллергические реакции.Напротив, как можно видеть из рис.

5.15, лекарственное вещество АХ554 в виде фармацевтической субстанции не вызывало изменений показателя85специфического лизиса лейкоцитов крови самцов морских свинок породыАгути.% лизированных лейкоцитов259,12*20159,73109,269,0250Исследуемая группаКонтрольАХ-554 225 мг/кгАХ-554 550 мг/кгОвальбумин 100 мг/кгПримечание: *- различия достоверны по сравнению с группой контроля прир<0,05 (U-критерий Манна-Уитни)Рисунок 5.15 – Реакция специфического лизиса лейкоцитов в крови у самцовморских свинок через 12 суток после сенсибилизации (M±m, n=10 в каждойгруппе)Результаты исследования количества эозинофилов в крови морскихсвинок, сенсибилизированных внутрижелудочным введением в течение 10дней веществом АХ-554 в дозах 225 мг/кг и 550 мг/кг, представлены на рис.5.16.Полученные данные свидетельствуют об отсутствии влияния АХ-554на уровень эозинофилов в крови животных. Количество эозинофилов в кровиморских свинок в опытных группах статистически значимо не отличалось отэтого показателя у контрольных животных.

Таким образом, АХ-554 в 5- и 10кратных СТД не вызывает аллергической реакции.86Количество эозинофилов в крови морских свинок, сенсибилизированных однократным внутримышечным введением овальбумина в дозе 100мг/кг, при введении разрешающей дозы значительно увеличилось, что свидетельствует о формировании аллергических реакций.0,10,081 *количество эозинофилов0,090,080,070,060,050,040,030,0170,020,0190,0220,010Исследуемая группаКонтрольАХ-554 225 мг/кгАХ-554 550 мг/кгОвальбумин 100 мг/кгПримечание: *- различия достоверны по сравнению с группой контроля прир<0,05 (U-критерий Манна-Уитни)Рисунок 5.16 –Количество эозинофилов в крови у самцов и самок морскихсвинок через 12 суток после сенсибилизации, 109/л (M±m, n=10 в каждойгруппе)Влияние АХ-554 на фагоцитарную активность нейтрофилов кровиморских свинок изучили в НСТ-тесте.