Диссертация (Возможности качественного определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты, в диагностике и прогнозировании течения острого коронарного синдрома и тромбоэмболии легочной артерии), страница 14

Комбинированная конечная точка убольных ТЭЛА включала наличие, как минимум, одного из следующихосложнений: летальный исход (от всех причин), обструктивный шок игемодинамически значимый рецидив ТЭЛА, развившихся в первые 30 суток или втечение 12 месяцев наблюдения.Всем пациентам определяли рост и вес.

Индекс массы тела (ИМТ)рассчитывали по формуле Кетле: ИМТ = Вес (кг) / Рост (м2). Под избыточнымвесом понимали ИМТ >25 кг/м2, за ожирение 1 степени принимали значения ИМТот 30 до 34,9 кг/м2, 2 степени – от 35 до 39,9 кг/м2, 3 степени – ≥40 кг/м2.2.3.2. Лабораторные методы исследованияКачественную оценку уровня сБСЖК проводил независимый исследователь(врач-кардиолог), который на момент выполнения тестов не имел информации оклинико-анамнестических, ЭКГ и лабораторных данных пациентов. Определениеуровней Нв, креатинина, МВ-КФК, сердечных тропонинов, BNP, NT-prоBNP, СРБи D-димера в крови проводили в клинико-диагностической лаборатории ГКБ №15 им.

О.М. Филатова ДЗМ. Количественное определение уровня сБСЖКвыполняли в Институте биомедицинских исследований Альянса компетенций«Парк активных молекул» (Обнинск).2.3.2.1. Определение уровня гемоглобинаУровень гемоглобина определяли количественным методом на анализатореMicrоs 60 (Hоriba ABX, Франция). Референсные значения составляли 120-140 г/лдля женщин, 130-160 г/л – для мужчин.2.3.2.2. Определение уровня креатинина сыворотки крови, расчет скоростиклубочковой фильтрации и клиренса креатинина71Креатинин сыворотки крови определяли при поступлении в стационар наанализаторе Advia 1800 (Siemens, Германия).

Референсные значения у женщинсоставляли 44-97 мкмоль/л, у мужчин – 44-115 мкмоль/л. Расчет скоростиклубочковой фильтрации проводили по формуле CKD-EPI Creatinine Equatiоn(2009), в модификации 2011 г., стандартизованной по площади поверхности тела взависимости от возраста, пола, этнической принадлежности и уровня креатинина,спомощьюэлектронногоонлайнhttp://ckdepi.оrg/equatiоns/gfr-calculatоr/.калькулятораРасчетклиренсанакреатининасайте(КК)выполняли по формуле Кокрофта-Голта (1976): КК = (140 - возраст, лет) x массатела (кг) x (1,23 для мужчин или 1,05 для женщин) / креатинин крови (мкмоль/л).2.3.2.3.

Определение содержания сердечного белка, связывающего жирныекислоты, с помощью экспресс-теста «КардиоБСЖК»Качественную оценку содержания сБСЖК в цельной венозной кровипроводилиприпоступлениивстационарспомощьюодностадийныхиммунохроматографических тестов «КардиоБСЖК» (ООО НПО «БиоТест», РФ) саналитической чувствительностью 10 нг/мл (в когорте 1 больных ОКС и упациентов с ТЭЛА) или 15 нг/мл (в когорте 2).Тест представляет собой индивидуальную диагностическую панель,состоящую из комбинации пористых материалов и биологических компонентов:фильтрационнойподушкидлявнесенияобразца,подушкиконъюгата,содержащей антитела к сБСЖК, конъюгированные с коллоидным золотом,нитроцеллюлозноймембраныстестовойиконтрольнойлиниямисиммобилизованными антителами и абсорбирующей подушки (рис.

2.2).Вносимый образец крови впитывается фильтрационной подушкой. Припрохождении подушки конъюгата сБСЖК образца взаимодействует с конъюгатомпервого антитела, нанесенного на подушку. В результате образуется окрашенныйиммунный комплекс антиген-антитело. Образовавшийся комплекс движется поддействиемкапиллярныхсилвдольнитроцеллюлозноймембраныивзаимодействует с иммобилизованными на тестовой линии вторыми антителами.72При наличии сБСЖК в образце крови выше порогового значения на тестовойлинии формируется окрашенная розово-пурпурная полоска. Если образецсодержит сБСЖК в концентрации ниже пороговой, тестовая линия остаетсянеокрашенной.

Не связавшийся на тестовой линии конъюгат мигрирует вдольнитроцеллюлозноймембраныинеизбежновзаимодействуютсиммобилизованными на контрольной линии антителами. В результате появляетсявторая окрашенная пурпурная полоска. Контрольная линия является внутреннимконтролем теста и, если анализ проведен правильно, проявляется независимо отсодержания сБСЖК в образце крови.Рисунок 2.2 – Устройство тест-полоски «КардиоБСЖК»Методика проведения теста «КардиоБСЖК»Шприцом для забора крови образец вносится в объеме 100-150 мкл вовальное окно тестовой планшеты до ограничительной риски.

Образец долженполностью впитаться. Результат оценивают через 20 мин, хотя при большойконцентрации сБСЖК он может проявляться и ранее указанного срока.Оценка результатов тестированияПоложительный: в окне просмотра результата появляются две окрашенныелинии – тестовая и контрольная. При появлении тестовой линии концентрация73сБСЖК в крови выше диагностического уровня некроза миокарда. Контрольнаялиния удостоверяет правильность использования планшеты. Интенсивность цветаконтрольной и тестовой линий может быть различной. Наличие окрашеннойрозовойтестовойполосылюбойинтенсивностисвидетельствуетоположительном результате (рис. 2.3).Отрицательный:появляетсятолькоодналиния–контрольная.Концентрация сБСЖК в крови ниже диагностического уровня.Неопределѐнный: если контрольная линия не проявилась, тест считается непрошедшим контроль качества и его результат недействителен.

В этом случаерекомендуется повторить анализ с помощью нового тест-набора [43].123451 – тест отрицательный; 2-5 – тесты положительныеРисунок 2.3 – Интерпретация результатов экспресс-теста «КардиоБСЖК»2.3.2.4. Определение содержания сердечного белка, связывающего жирныекислоты, с помощью тест-набора «КАРД-ИНФО»Действие теста «КАРД-ИНФО» (ООО «ОФК-Кардио», РФ) с аналитическойчувствительностью 7 нг/мл основано на иммунохроматографической реакциикомбинациимоно-иполиклональныхантителссБСЖК.Одинвидмоноклональных антител конъюгирован с коллоидным золотом (красителем),74другой нанесен и иммобилизован в тестовой зоне тест-полоски.

При внесениикрови жидкость мигрирует вдоль тест-полоски по принципу тонкослойнойхроматографии. Вместе с жидкостью движутся и антитела с красителем. Если впробе присутствует сБСЖК в концентрации выше пороговой, то происходит егосвязывание с антителами, как конъюгированными с коллоидным золотом, так инанесенными на мембрану тест-полоски. При этом в тестовой зоне полоскиобразуется многослойный комплекс первых и вторых антител к сБСЖК(«сэндвич»-комплекс), который проявляется в виде розовой линии.Методика проведения теста «КАРД-ИНФО»С помощью скарификатора и пипетки производится забор несколькихкапель капиллярной крови из пальца руки.

В овальное окошко тест-полоскидобавляют одну каплю (около 30 мкл) крови из пипетки и 2 капли (около 50 мкл)буферного раствора из одноразовой капельницы. Результат определяют втестовом окне не позднее, чем через 20 мин после внесения крови (рис. 2.4).Рисунок 2.4 – Устройство тест-кассеты «КАРД-ИНФО»Интерпретация результата тестированияПоложительный результат: проявляются две четкие розовые линии: одналиния в тестовой зоне «T», другая – в контрольной зоне «С». Любой оттенокрозового в тестовой зоне «T» рассматривается как положительный результаттестирования.

Интенсивность окраски тестовой линии зависит от концентрации75сБСЖК в крови. При малом его количестве (7-30 нг/мл) тестовая линия можетбыть тусклой.Отрицательный результат: проявляется одна розовая линия в контрольнойзоне «С». В тестовой зоне «T» розовая линия не проявляется.Ошибка тестирования: цветная линия в контрольной зоне «С» непроявляется (вне зависимости от наличия или отсутствия линии в тестовой зоне«Т»).Наиболеечастымипричинамиошибкитестированияявляютсянедостаточный или избыточный объем образца крови или буферного раствора,несоблюдение инструкции по применению и условий хранения теста. В этомслучае тестирование следует повторить при помощи другого тест-набора.2.3.2.5. Определение содержания сердечного белка, связывающего жирныекислоты, и сердечного тропонина I с помощью теста «КАРД-ИНФО 1+1»Качественное одновременное определение содержания двух биомаркеров(сБСЖК и cТн I) выполняли с помощью экспресс-теста «КАРД-ИНФО 1+1» (ООО«КАРДИО-Плюс», Россия) с аналитической чувствительностью к сБСЖК 7 нг/мл,к cТн I – 1,2 нг/мл.

Тест обеспечивает выполнение одноэтапного экспресс-анализаin vitrо для выявления сБСЖК и cTн I в венозной крови, сыворотке или плазме.Принципдействиятеста«КАРД-ИНФО1+1»основаннаметодеиммунохроматографического анализа. Тест-полоска, укрепленная в пластиковойкассете, содержит моноклональные мышиные антитела против сБСЖК (клоныF10 и F9) и cТн I (клоны IC19 и IC4). Один клон моноклональных мышиныхантител к сБСЖК и к cТн I конъюгирован с коллоидным золотом (красителем),другой – нанесен в виде узких линий в тестовой зоне тест-полоски.

При внесениипробы жидкость начинает мигрировать вдоль тест-полоски по принципутонкослойной хроматографии.Методика постановки теста «КАРД-ИНФО 1+1»С помощью скарификатора и пипетки, входящих в набор, производитсязабор нескольких капель капиллярной крови из пальца руки, либо заборнескольких мл венозной крови.76В малое окошко овальной формы тест-полоски добавляется одна капля(около 30 мкл) крови из пипетки. Туда же из одноразовой капельницы (флакона)добавляют 2 капли (около 50 мкл) буферного раствора. Результат тестированияопределяют в тестовом окошке не позднее, чем через 20 мин с момента внесениякрови и буферного раствора (рис. 2.5).Интерпретация результата тестированияПоложительная реакция: если в пробе присутствует определяемый антиген(сБСЖК и/или cТн I), то по мере продвижения жидкости происходитвзаимодействие с моноклональными мышиными антителами, конъюгированнымис коллоидным золотом, и образование специфического комплекса с антигеном.