Диссертация (Способы коррекции ранних механизмов канцерогенеза в органах репродуктивной системы), страница 12

Сравнение продолжительности жизни мыши и56человека показывает, что применение ДИМ в сочетании с введением вакцины,может быть эффективным у людей, уже инфицированных вирусом.1.6. ЗаключениеПрогрессирование предраковых изменений обусловливается сочетаниемразличных патогенетических факторов.

Установлена значимость раннихмеханизмовканцерогенезарепродуктивнойсистемы.приразличныхПониманиерядалокализацияхопухолеймолекулярно-генетическихизменений на ранних стадиях позволяет формировать и развивать стратегиюпрофилактики и лечения рака репродуктивных органов.Протоонкогены на ранних этапах канцерогенеза в основном находятся поджестким контролем. Последующие стадии характеризуются повреждением ДНКи затем ведут к активации проонкогенов и инактивации генов-онкосупрессоров.Прогрессивное накопление повреждений в онкогенах и генах-онкосупрессорахобусловливает направленное развитие опухоли и в конечном итоге ведет к еемалигнизациииметастазированию.Впоследнеевремяширокоераспространение получила также эпигенетическая концепция канцерогенеза,согласнокоторойтрансформациивклетокосновележатпервичныхнарушенияпроцессовзлокачественнойэпигенетической организациихроматина - аномалии метилирования ДНК или ковалентных модификацийгистоновых белков [Jones P.A., 2002].Паттерны метилирования ДНК ихроматиновая структура существенно меняются при развитии новообразованийи играют важную роль как в инициации, так и прогрессии рака.

Модулированиеэпигенетических изменений дает перспективную основу для разработки новыхметодов терапии предраковых заболеваний. Однако, к настоящему времениклиническая значимость генетических и эпигенетических изменений в ходераннего канцерогенеза в репродуктивных органах человека остется крайнемалоизученной. Более того, в отношении значимости процессов ранних стадий57гормонального канцерогенеза у человека также существует значительныйдефицит клинических данных. При этом гормонозависимость злокачественныхопухолей, имеющих происхождение из органов репродуктивной системы, сталаосновой большиства методов их химиотерапии. В определенной степени этокасается и механизмов, связанных с изменениями в цитокиновом окруженииклеток, составляющих морфологический субстрат будущей злокачественнойопухоли.

Таким образом, на сегодня отсутствует общее теоретическоеосмысление патогенеза ранних стадий канцерогенеза в репродуктивных органахчеловека, которое имело бы как клинические доказательства, так исоответствующие ему практические подходы в здравоохранении. Некоторымисключением является лишь ВПЧ-зависимый канцерогенез в шейке матки,понимание которого уже привело к созданию средств вакцинопрофилактикиРШМ. Таким образом, актуальность настоящего исследования обусловленанеобходимостью создания единой концепции раннего канцерогенеза врепродуктивных органах человека, которая дала бы основу для разработкисоответствующих направлений химиопрофилактики.58ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ2.1.

Изучаемые субстанции и препаратыДля проведения экспериментов использованы следующие активныевещества и фармацевтические препараты:Эпигалокатехин-3-галлат изучен в виде фармацевтической субстанции«Эпигаллокатехин»ссодержаниемактивноговеществаEGCG70%(«МираксБиоФарма», Россия).Прототип пероральной лекарственной формы EGCG «Каспазол» ссодержаниемсубстанции«Эпигаллокатехин»112мгнакапсулу(«МираксБиоФарма», Россия).3,3’-диндолилметан изучен в виде фармацевтической субстанции«Дииндолилметан»ссодержаниемактивноговеществаDIM>95%(«МираксБиоФарма», Россия).Прототип пероральной лекарственной формы DIM «Инфемин» ссодержаниемсубстанции«Дииндолилметан»150мгнакапсулу(«МираксБиоФарма», Россия).Лекарственноесредство«ИндинолФорто»(индолкарбинол)ссодержанием индол-3-карбинола 200 мг на капсулу («МираксБиоФарма»,Россия).2.2.

Материалыиметодыэкспериментальныхисследованийналабораторных животных2.2.1. Лабораторные животные и их содержание2.2.1.1. Животные и их содержаниеТоксикологические исследования были проведены на белых нелинейныхмышах и крысах (самцы и самки), возраст 3 месяца. Острая токсичностьопределялась на мышах и крысах обоих полов. В группах по 5 или 6 животных(каждого пола, плюс такие же контрольные группы) изучалась каждая дозировка59препаратов. Контрольные животные получали воду в аналогичном объеме.

Висследованияххроническойтоксичностидлякаждойдозыпрепаратаиспользовались группы по 20 самцов и самок (по 3 группы каждой дозы каждогопрепарата и контрольная группа). В исследованиях аллергизирующего действияпрепаратов использовались группы морских свинок обоего пола по 6 животныхв группе.Исследование активности гистондеацетилазы проводили на 40 крысахсамцах (по 20 в экспериментальной и контрольной группах).Исследование метилирования генов проводили на 40 нелинейных крысахсамках (по 20 в экспериментальной и контрольной группах) с индуцированнымгиперметилированием генов.В исследованиях гормональных механизмов канцерогенеза (метаболитыэстрогенов) были использованы самки мышей линии Balb/c-nude(nu/nu). Возрастмышей 5-6 недель, масса 19-25 г. Использовано по 25 мышей вэкспериментальной и контрольной группах.

В исследованиях с перевитойопухолью двух линий рака простаты были использованы самки мышей линииBalb/c-nude(nu/nu). Возраст мышей 5-6 недель, масса 19-25 г. В исследованиипрямого противоопухолевого действия было 4 группы, по 30 животных в каждой(по 2 экспериментальных и контрольных группы). В исследовании влиянияпрепарата на туморогенность клеток опухолей также были аналогичные 4группы, по 20 животных в каждой.Корм и вода: PMI LabDiet 5K67 идистиллированная вода, стерилизованные.2.2.1.2.

Содержание животныхЖивотные находились в отдельных комнатах. Мышей Balb/c-nudeсодержали в клетах по 4-8 мышей, соединенных с устройством длякондиционирования воздуха. В качестве подстила использовался «Лигноцель».Подстил и клетки предварительно были стерилизованы автоклавированием.2.2.1.3. Наблюдение за животными60Каждое животное ежедневно осматривалось для оценки общегосостояния и поведения. Для взвешивания животных использованы электронныевесы ВЛР-500 с точностью взвешивания 0,1 г. Вывод животных изэксперимента производился путем ингаляции эфира (для наркоза) либодекапитацией с помощью гильотины.2.2.2.

Лабораторные исследования2.2.2.1. Гематологическиеибиохимическиеисследованияулабораторных животныхКровь у животных отбиралась натощак. В рамках гематологическихисследований у животных определялись: содержание гемоглобина в крови,гематокрит, содержание эритроцитов, ретикулоцитов, тромбоцитов, лейкоцитов,лейкограмма (лейкоцитарная формула), СОЭ.В рамках биохимических исследований крови у животных определялись:общийбелок,щелочнаяфосфатаза,аланинаминотрансфераза(АЛТ),аспартатаминотрансфераза (АСТ), лактатдегидрогеназа, щелочная фосфатаза,глюкоза, мочевина, креатинин, холестерин, общие липиды, билирубин, калий,натрий, кальций.2.2.2.2.

Общий анализ мочиПри выполнении общего анализа мочи определялись: плотность, реакция(pH), проводилась микроскопия осадка, наличие белка, глюкозы, кетоновых тел,желчных пигментов.2.2.3. Исследования общей физиологииГексеналовая проба. Детоксицирующая функция печени определялась подлительности гексеналового сна. Крысе внутрибрюшинно вводился 2% р-ргексенала в дозировке 90 мкл/кг.

Регистрировалось время наступления сна (попереходу в боковое положение) и пробуждения (вставание).61Офтальмологическое исследование предусматривало осмотр слизистыхоболочек, определение роговичных рефлексов, измерение величины зрачка иширины глазной щели.Измерение артериального давления и запись ЭКГ.Крыс помещали в специальные пеналы. АД регистрировали у крыс нахвосте с помощью пьезoэлектрического датчика и манжетки.Определениеректальнойтемпературыделалосьспомощьюэлектрическoго медицинскoго термoметра ТПЭМ-1 (точность ±1%).Исследования аллергизирующего действия препаратов проводились на 3группах морских свинок по 6 животных, которые получали две дозы препаратаили воду (в контрольной группе).

Введение препарата осуществлялосьвнутрижелудочно в течение 5 дней.Для проведения реакции иммунных комплексов через 10 суток послепоследнего введения препарата внутрикожно вводили его разрешающую дозу.Эту дозу определяли на интактных животных с наибольшим разведениемпрепарата, не вызывающим видимых изменений в коже через час послевнутрикожной инъекции.