Диссертация (Оценка воздействия потенциальных загрязнителей на световые реакции фотосинтеза в присутствии гуминовых веществ), страница 4

В данной диссертационной работе мы будемпридерживаться номенклатуры, предложенной Гольцевым и сотр. (Гольцев ссоавт., 2014; Strasser et al., 2004). Максимумы (обозначаемые буквой I) ипоследующие минимумы (обозначаемые буквой D) пронумерованы (с помощьюиндекса) согласно времени их появления в индукционной кривой ЗФ (Рисунок 7).ИндукционнаямногофазовуюкинетикавременнуюЗФпредставляетфункцию,собойпроходящуюоченьчерезсложнуюнесколькопоследовательных максимумов и минимумов и через 2–3 мин освещения светомФАР достигает стационарного уровня (Гольцев с соавт., 2016). Индукционнуюкривую ЗФ можно разделить на две кинетические фазы – быструю и медленную.Быстрая фаза начинается подъемом свечения к максимуму I1 и заканчивается24минимумом D2 через приблизительно 0,3–0,5 с освещения, после чего начинаетсямедленная фаза изменений ЗФ, которая за несколько минут освещениязаканчивается достижением интенсивности ЗФ светового стационарного уровняS.

При использовании механического фосфороскопа детальную структурубыстрой фазы можно наблюдать только при использовании быстрых затворов,обеспечивающих быстрое включение возбуждающего света (скорость открывания– быстрее 1 мс), и высокой скорости дигитализации и регистрации сигнала.Быстрая фаза включает два пика I1 и I2 (иногда разделенные минимумом D1 междуними) и заканчивается минимумом D2. При регистрации ИК ЗФ более быстрымиаппаратами с электронным переключением периодов освещения и темноты(например, М-РЕА-2) на начальном фронте нарастания ЗФ можно заметить«плечо», которое, вероятно, отражает слитый с максимумом I1 ранний пик (егоможно назвать максимумом I0).

При некоторых условиях измерения последостижения минимума D2 интенсивность свечения медленно нарастает, образуянебольшое плечо, которое идентифицируют как максимум I3. С этого моментастартует нарастание ЗФ к максимуму I4, принадлежащему к медленной фазе ИК ипоследующим промежуточным максимумам I5 и I6, после которых интенсивностьЗФ достигает стационарного уровня S (Strasser et al., 2010).25Рисунок 7.

Типичная индукционная кинетика микросекундной ЗФ листьевфасоли, регистрированная с помощью аппарата М-РЕА-2 при интенсивностивозбуждающего света 1000 мкмоль квантов·м–2··с–1. Буквами около кривойотмечены характеристические точки – локальные максимумы (буквами I1 … I6)или минимумы (D1, D2) и стационарное состояние световой адаптации (S).

Ввыноскахописаныпредполагаемыепроцессы,определяющиеинтенсивности ЗФ в указанный момент (Гольцев с соавт., 2014).изменение261.5. Методы измерения флуоресценции хлорофиллаПоглощение энергии при освещении растений возбуждающим светомвызываетфотохимическиереакциифотосинтеза исопровождающуюихфлуоресценцию хлорофилла в фотосинтетическом аппарате, а непоглощеннаячасть света отражается от поверхности листа или рассеивается внутреннимиструктурами. Измерение флуоресценции хлорофилла требует ее разделения отрассеянного объектом света.

Для измерения флуоресценции хлорофиллаиспользуют спектрофлуориметры, у которых принцип измерения основан наэмиссионной спектроскопии. До настоящего времени разработаны ряд методовизмеренияфлуоресценциииширокийспектрфлуориметров.Наиболеепрактичными и часто используемыми методами измерения являются прямаярегистрация флуоресценции и модулированная флуоресценцияАлексеев, 2013).(Маторин,271.5.1. Регистрация индукции флуоресценции хлорофиллаИзмерение производится после адаптации фотосинтезирующего объекта ктемноте (около 20–30 мин), что определяет «затухание» процессов, связанных сосветовой фазой фотосинтеза. Как правило, в темноте переносчики электронов вэлектрон-транспортной цепи окисляются (Рубин, 2013).

Затем образец освещаетсянепрерывным светом длиной волны короче 670 нм (что достигается с помощьюоптических фильтров или специальных диодов или диодных лазеров). Свключениемвозбуждающегосветафотоприемникрегистрируетсветфлуоресценции хлорофилла в диапазоне длин волн примерно от 680 нм до 760 нм.По характеру кривой индукции флуоресценции можно судить о некоторыххарактеристиках фотосинтетического аппарата образца и динамике протеканияреакций фотосинтеза. В конце фазы индукции флуоресценции хлорофилла(достижения постоянного уровня FT) при непрерывном освещении образцафлуориметр измеряет стационарную интенсивность флуоресценции хлорофилла(Рисунок 8).

Описанная выше типичная система измерения флуоресценциихлорофилла называется системой с постоянным возбуждением (от англ.continuous excitation type chlorophyll fluorescence system). Она состоит изисточника возбуждающего света около 3500 мкмоль квантов·м–2·с–1 с длинойволны 650 нм и детектора с фильтром, который позволяет регистрировать толькоизлучение с λ > 700 нм (Рисунок 8). Детектор, регистрирущий флуоресценциюхлорофилла, передает сигнал на усилитель, а затем сигнал преобразуется вцифровой вид и загружается в микропроцессор для расчета требуемыхпараметров флуоресценции (Гольцев с соавт., 2014).Описанный метод используется во флуориметрах, которые оцениваютуровень стресса в растении (так называемый Plant Strеss Meter).

Такиефлуориметрымогутрегистрироватьианализироватькривыеиндукциифлуоресценции хлорофилла за короткие времена облучения действующим светом,как правило – до 10 секунд, но измерение должно проводиться после темновой28адаптации растения (в зависимости от характера исследования от 20 минут донескольких часов).Рисунок 8.

Схема измеряющей головки флуориметрa Handy PEA (HansatechInstruments Ltd., Великобритания).При использовании этой методики определяются следующие параметры:FO - начальная (нулевая) флуоресценция;FM - максимальная флуоресценция;FV - переменная флуоресценция;FV / FM - максимальная эффективность ФС ΙΙ;TFM - время для дoстижения FM;PI- индекс производительности ФС аппарата;AM - площадь поверхности над индукционной кривой флуоресценциихлорофилла.Благодаря быстрому развитию технологий современные флуориметры могутрегистрировать основные параметры флуоресценции, определяемые по форменачальной фазы кривой Каутского.

Аппараты оснащены источником светавысокой интенсивности (выше 2500 мкмоль квантов·м–2·с–1) и фотоприемником смикропроцессором, которые обеспечивают быстрое и точное проведениеизмерений(разрешениеповремени10мкс),чтопозволяетизмерять29интенсивность флуоресценции на коротких временах, в том числе на начальныхфазах индукции (Рисунок 9). Таким образом, по флуоресценции можно наблюдатьход первичных реакций фотосинтеза. При детальном анализе измеряемыхсигналов (JIP-тест) можно оценить воздействие целого ряда стрессовых факторовна растения (Strasser et al., 2010).Рисунок 9.

Кривая индукции флуоресценции хлорофилла, измеренная втечение короткого периода времени (Hansatech Instruments Ltd., UK).301.5.2. Модулированная флуоресценция хлорофиллаВведение измерения модулированной флуоресценции хлорофилла – системыPAM (от англ. Pulsе Amplitude Modulation) – произвело революцию висследовании этого явления. В этой системе для возбуждения флуоресценциихлорофилла используются источник, излучающий модулированный свет, которыйвключается и выключается через определенные промежутки времени, и детектор,регистрирующий только переменную составляющую индуцированной в образцефлуоресценции (Рисунок 10).

Таким образом, флуоресценции хлорофилла можетбыть измерена в присутствии дополнительного источника действующего света слюбым спектральным составом, а также солнечного света (Гольцев с соавт.,2014).Рисунок 10. Схема, представляющая регистрированные световые сигналы надетекторе при различных режимах работы: А – флуоресцентный сигнал,записаный с использованием только модулированного света; B – во времясовместного освещения действующим и модулированным светом; C – послефильтрациипостоянногокомпонентадействующегосвета–только31флуоресценция,сопровождающаяфотохимическиереакциихлорофилла(Hansatech Instruments Ltd., Великобритания)При этой системе измерения свет включается на короткое время (1–3 мкс),этот интервал времени достаточен для определения импульса флуоресценциихлорофилла.

На детектор этого аппарата попадают три вида световых сигналов(Рисунок 10):1) рассеянный от поверхности объекта действующий свет (непрерывноеосвещение);2) сигнал флуоресценции объекта, индуцированной действующим светом(непрерывный сигнал);3)импульсно-индуцированныйсигналфлуоресценции,возбуждаемоймодулированным светом; именно этот сигнал флуоресценции усиливается вэлектронном виде, а другие, неимпульсные сигналы, игнорируются (Гольцев ссоавт., 2014).Измерения могут проводиться на целых листьях или их частях, а также насуспензиях хлоропластов или клеток водорослей, адаптированных к темноте илина свету (Strasser et al., 2010).ТехникасиспользованиемPAM-технологииобеспечиваетнадежноеизмерение уровня начальной флуоресценции FO, так как измерительный луч светаимеет такую низкую интенсивность, что не инициирует фотохимические реакции.При использовании системы PAM измерение начинается включением оченьслабого импульсного луча модулированного излучения, ML (от англ.