Диссертация (Оценка воздействия потенциальных загрязнителей на световые реакции фотосинтеза в присутствии гуминовых веществ), страница 2

Показательфлуоресценции (FО) с успехом может быть использован в биотестировании дляоценки влияния токсикантов на ростовые процессы микроводорослей.Материалы диссертации могут быть внедрены в учебный процесс подисциплинам «Экология» и «Охрана окружающей среды и рациональноеиспользование природных ресурсов».Полученные результаты использовали в учебном процессе при проведениипрактикума по экологической биофизике на Звенигородской станции МГУ ибольшого практикума кафедры биофизики МГУ.Метод флуоресценции хлорофилла был внедрен в исследования побиотестированию в лабораторию экотоксикологического анализа почв (ЛЭТАП)на факультете почвоведения МГУ.Апробация работы.

Результаты работы представлены в следующих научныхконференциях: 4-я международная конференция СНГ МГО по гуминовыминновационным технологиям «От молекулярного анализа гуминовых веществ – кприродоподобным технологиям» (Москва, 2017); II всероссийская научнаяконференция молодых ученых «Комплексные исследования Мирового океана»(Москва,2017);всероссийскаянаучно-практическаяконференциясмеждународным участием «Морские биологические исследования: достижения иперспективы», приуроченная к 145-летию Севастопольской биологическойстанции (Севастополь, 2016); международный симпозиум «Биодиагностика иоценка качества природной среды: подходы, методы, критерии и эталонысравнения в экотоксикологии» (Москва, 2016); 10-я международная конференция«Углерод: фундаментальные проблемы науки, материаловедение, технология»(Троицк, 2016); 3-й международный симпозиум «Nanomaterials and theEnvironment» (Moscow, 2016); конференция Математика Компьютер Образование2016 (Москва, 2016); V съезд биофизиков России (Ростов-на-Дону, 2015).Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 15 работ, в томчисле 5 статей в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК МинобрнаукиРФ и 3 в цитируемых в международных базах данных Scopus, Web of Science,9RSCI, а одна из них опубликована в высокорейтинговом журнале.Исследования выполнялись при поддержке по грантам РФФИ: «Поискграницнормыдлябиоиндикационныхпоказателейфитопланктонавмногофакторных экспериментах с лабораторными альгоценозами» (15-04-02601),«Метод поиска экологически обоснованных границ классов качества дляобъективной классификации природных экосистем» (15-04-02129).10ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ1.1.Общая характеристика процесса фотосинтезаФотосинтез – наиболее важный биоэнергетический процесс на Земле,благодаря которому возможны само существование жизни и функционированиебиосферы.

Используя солнечную энергию, фотосинтезирующие организмыпроизводят углеводы и другие органические соединения из СО2 и воды.Фотосинтез происходит в растениях, водорослях и некоторых бактериях, в томчисле в сине-зеленых водорослях (Гольцев с соавт., 2014; Заворуева с соавт.,2011; Заядан, Маторин, 2015; Ильяш, Маторин, 2007).В растениях этот процесс происходит в хлоропластах, внутри которыхнаходятся строма и тилакоиды (Плеханов, Чемерис, 2003). В мембранахтилакоидов осуществляется световая фаза фотосинтеза, в то время как стромасодержит ферменты, необходимые для темновой фазы фотосинтеза (циклаКалвина–Бенсона) (Рисунок 1).В результате чрезвычайно сложного, многоступенчатого процесса, частьэнергии поглощенного фотона сохраняется для энергетического метаболизмаклетки в виде стабильной химической энергии органических соединений.Обобщенно процесс фотосинтеза можно описать следующей упрощеннойформулой (Гольцев с соавт., 2014):CO2 + H2O + световая энергия → CH2O + O2.Поглощение, трансформация и сохранение энергии в процессе фотосинтезавключают четыре основных этапа.1.

Поглощение света и перенос энергии по пигментной антенне к активнымцентрам.2. Транспорт электронов (первичное разделение зарядов в активных центрахи передача электрона от возбужденного пигмента реакционного центра какцептору, например феофитину).113.Стабилизацияэнергииокислительно-восстановительных«возбужденных»реакцийэлектронов(фотосинтетическийспомощьютранспортэлектронов) и синтез АТФ и НАДФН.4. Синтез и экспорт стабильных продуктов фотосинтеза.Рисунок 1. Две фазы фотосинтеза и их взаимодействие в рамкаххлоропласта. Фаза, зависящая от света (световая фаза), происходит в тилакоидах,в них образуются соединения, обладающие силой ассимиляции (НАДФН и АТФ),которые используются в темновой, не зависящей от света фазе (цикл Кальвина–Бенсона).

Во время темновой фазы в строме происходит редукция CO2 до сахаров(органические соединения) (Гольцев с соавт., 2014).Несмотря на большое разнообразие в организации фотосинтетическогоаппаратаразличныхтиповиклассовфотосинтезирующихорганизмов(хлоропласты, хроматофоры, отдельные тилакоиды, различия в наборе пигментови т.д.), существует удивительная универсальность в структуре первичных этаповтрансформации световой энергии в химическую.

Начальный этап фотосинтеза –световая стадия, в ходе которой осуществляется поглощение и фотохимическоепреобразование энергии света (Рисунок 2). У растений световая стадия протекаетв тилакоидных мембранах хлоропластов с участием пяти типов надмолекулярныхбелков и пигмент-белковых комплексов. Два из них, хлорофилл-белковыекомплексы первой и второй фотосистем (ФС I и ФС II), несут реакционныецентры (РЦ), в которых происходит первичная конверсия световой энергии, атакже молекулы хлорофилла а. Последние выполняют функции внутренней12антенны и обеспечивают эффективную миграцию энергии в пределах комплекса кРЦ (Гольцев с соавт., 2014).Два типа центров, относящихся к ФС I и ФС II, объединены в единуюсистему с помощью переносчиков электронов и протонов вместе с комплексомцитохромом b6/f.

В фотосистеме I поглощение энергии используется для переносаэлектронов к низкопотенциальному акцептору, который через ряд переносчиковвосстанавливает НАДФ+. Фотосистема II включает в себя РЦ и другиекомпоненты, участвующие в окислении воды, выделении молекулярногокислорода, переносе протонов и электронов, восстанавливающих реакционныецентры ФС I.ФС II окисляет воду, что сопровождается выделением кислорода. Окислениеводы катализируется кислородвыделяющим комплексом (КВК), представляющимсобой один из главных компонентов ФС II. Вода является источником электронови протонов, а в качестве побочного продукта в результате фотолиза водыобразуется кислород, выделяющийся в наружную среду. Поскольку эта реакцияявляется практически единственным источником кислорода на нашей планете,важность ее трудно переоценить (Маторин, Алексеев, 2013).ФСΙΙФСΙРисунок 2.

Тилакоидная мембрана с четырьмя интегральными мембраннымибелковыми комплексами (ФС I, ФС II, цитохром b6f и АТФ-синтаза) связана сциклом Кальвина в строме, кислород выделяющий комплекс, ФС I – фотосистема13I, ФС II – фотосистема II, P680 – Хл реакционного центра ФС II, PQ и PQH2 –пластохинон и восстановленный пластохинон, комплекс цитохрома b6f, PC –пластоцианин, FeS – связанный железо-серный акцептор ФС I, P700 – Хл (Allen etal., 2011).Еще один комплекс – светособирающий (ССК), содержащий хлорофилл идругие пигменты – не участвует в электрон-транспортных реакциях, но играетважную роль в поглощении квантов света и в передаче энергии света нафотосистемы.Ассиметрия расположения основных электрон-транспортных комплексов втилакоидных мембранах создает структурную основу для направленноготрансмембранного переноса электронов, сопряженного с накоплением протонов иобразованием электрохимического градиента протонов (Н), на тилакоидныхмембранах.

Энергизация тилакоидных мембран, происходящая в результатетрансмембранного переноса электронов и протонов, обеспечивает образованиеАТФ за счет активности АТФ-сопрягающего комплекса (Маторин, Рубин, 2012).Поглощение света антенным комплексом фотосистемы I приводит квозбуждению и окислению хлорофилла реакционного центра Р700, при этомположительная дырка Р700+ закрывается в результате окисления пластоцианина,подводящего электроны от фотосистемы II.

При возбуждении Р700 отдает одинэлектрон на первичный акцептор А0, после чего электрон по градиенту редокспотенциала переносится на филлохинон (А1) и комплекс 4Fe-4S –кластеров,обозначаемых как Fx, Fa, Fb. С этих кластеров происходит одноэлектронноевосстановление ферредоксина, который в свою очередь восстанавливает НАДФ+при участии ферредоксин-НАДФ+-оксидоредуктазы.

Электронный транспорт отводы к НАДФ+ называется нециклическим и его результатом являетсявосстановление НАДФН и синтез АТФ. В тилакоидной мембране возможен такжециклический перенос электронов вокруг фотосистемы I, связанный с созданиемтолько протонного градиента и синтезом АТФ. Образованные в световой стадиифотосинтеза НАДФН и АТФ затем используются в биохимических реакциях,14протекающих в строме хлоропласта, и связанных с фиксацией СО2 в циклеКальвина-Бенсона (Маторин, Алексеев, 2013).151.2.

Характеристика флуоресценции хлорофилла растенийСолнечная энергия (свет), достигающая поверхности листьев в виде потокафотонов, поглощается молекулами фотосинтезирующих пигментов, главнымобразом хлорофилла светособирающих комплексов. В этих комплексах (такженазываемыми антеннами) поглощенная энергия в виде электронного возбуждениямолекул красителя может передаваться к реакционным центрам ФС ΙΙ и ФС Ι ииспользоваться для запуска фотохимических реакций (Рубин, 2013).

Не всяпоглощенная энергия используется на фотосинтез, известная часть переносимойпо антенне энергии возбуждения не достигает реакционного центра, а теряется ввиде тепла или испускается в виде флуоресценции хлорофилла (Рисунок 3).Рисунок 3. Пути расходования световой энергии, получаемой листьями.ФАР – фотосинтетически активная радиация, УФ – ультрафиолетовое излучение,ДК – дальний красный свет, близкая инфракрасная область, ИК – инфракрасноеизлучение (Гольцев с соавт., 2014).Флуоресценция хлорофилла а представляет собой вторичное излучениесветовой энергии, поглощенной молекулой хлорофилла (Shreiber et al., 1995).Часть поглощенной энергии, которая теряется для процесса фотосинтеза в видефлуоресценции, мала и, хотя составляет только от 3 % до 5 %, является для насисточником важной информации (Рисунок 3).

Флуоресценция хлорофилла а вовремя фотосинтеза является мерой энергии поглощаемых квантов света, которые16не были использованы в процессе фотосинтеза, и не были рассеяны в виде тепла.Принормальнойиэффективнойработефотосинтетическихреакцийинтенсивность флуоресценции хлорофилла а остается низкой, а любое нарушениепроцессафотосинтезапонижаетегоэффективность,чтоприводиткзначительному увеличению флуоресценции (Маторин, Рубин, 2012).После поглощения фотона валентный электрон в молекуле хлорофиллапереходит на более высокий энергетический уровень.

При поглощении квантафиолетового или синего излучения энергия синглетного уровня выше, чем вслучае возбуждения красным светом. Эти переходы происходят за время порядкафемтосекунды (10–15 с), а за время около 10–13 с молекула рассеивает частьизбыточной энергии в виде тепла и переходит на нижний энергетический уровеньэлектроного возбуждения (Рисунок 4). Пребывание в нижнем электронномвозбужденном состоянии не длится слишком долго, так как возбуждение молекулхлорофилла имеет тенденцию быстро (примерно за 10–9 с) вернуться в основноесостояние, а энергия может быть потеряна в результате теплообмена илифлуоресценции квантов (λmax = 685 нм).

Остальная энергия используется дляработы фотосинтетического транспорта электронов, который начинается, когда,мигрируяпоантенневозбуждение,достигаетмолекулыхлорофилла,находяящейся в реакционном центре ФС ΙΙ или ФС Ι (Погосян, 2006).Флуоресценцияхлорофиллавсегдаосуществляетсяснижнеговозбужденного состояния и, следовательно, излучается только красный свет, хотяхлорофилл поглощает излучение и в более коротковолновом диапазоне, достигаяпри этом более высокого энергетического возбужденного состояния молекулы(Корнеев, 2002). Максимум излучения флуоресценции хлорофилла а расположенв более длинноволновой области спектра, чем максимум поглощения хлорофилла(Рисунок 5). Максимальная флуоресценция молекул хлорофилла в растворепетролейного эфира наблюдается при 668 нм, а максимум поглощенияприходится на 663 нм (сдвиг Стокса).