Диссертация (Оценка воздействия потенциальных загрязнителей на световые реакции фотосинтеза в присутствии гуминовых веществ), страница 3

В листьях максимум флуоресценции прикомнатной температуре наблюдается около 685 нм, а простирается спектрфлуоресценции до 800 нм (Антал, 2000; Маторин, Алексеев, 2013).17Рисунок 4. Изменение уровня энергии в молекуле хлорофилла а припоглощении света и возвращении в исходное состояние (модифицированно поhttp://en.wikipedia.org/ wiki/Image).В листьях хлорофилл а в среднем содержится в три раза больше, чемхлорофилла b. В здоровых листьях растений флуоресценция излучаетсяпрактически только молекулами хлорофилла а, находящимися преимущественнов ФС ΙΙ (Strasser et al., 1995). Хлорофилл b передает почти 100 % энергиивозбуждения на хлорофилл а.

Следовательно, флуоресценция излучаетсяхлорофиллом а в сотни раз чаще, чем хлорофиллом b. Флуоресценциихлорофилла использовалась для оценки действия различных ингибиторовэлектронного транспорта в световой фазе фотосинтеза, таких как диурон (DCMU)(3-(3,4-дихлорфенил)-1,1-диметилмочевины),паракват(N,N'-диметил-4,4'-дипиридил дихлорида) или нигерицин. DCMU использовали, чтобы блокироватьэлектронный транспорт после QA, комбинируя это воздействие с замораживанием18объекта до температуры 77 К. Такой подход оказался полезным в последниедесятилетия исследований фотосинтетического аппарата (Strasser et al., 2004).Рисунок 5. Спектр флуоресценции хлорофилла (Гольцев с соавт., 2014).Вусловияхоченьнизкихтемператур(77К)спектризлученияфлуоресценции хлорофилла показывает ясные полосы, характерные для антенныхкомплексов ФС II и ФС I, давая информацию об обмене и распределении энергиимежду двумя фотосистемами (Strasser et al., 2004).

При температуре 77 К вспектре излучения флуоресценции наблюдаются три пика: 685, 695 и около 735нм. Первые два относятся к ФС II, тогда как излучение при 735 нм происходит отФС I. Величина каждого максимума флуоресценции хлорофилла при 77 К зависитот уровня фосфорилирования антенного комплекса ССКII. В состоянии 2 ССКIIне фосфорилирован. В этом состоянии отношение интенсивности Фл хлорофиллапри 685 и 695 нм к интенсивности флуоресценции при 735 нм значительно ниже,чем в состоянии 1, когда ССКII фосфорилирован (Гольцев с соавт., 2014).В 1931 году Каутским и Хиршем впервые была описана обратная связьмежду активностью флуоресценции хлорофилла и фотосинтетического аппарата(при фиксированной потере тепла). Они заметили, что их соотношение позволяетнам использовать данные измерений параметров флуоресценции хлорофилла для19описания реакций фотосинтеза и, в частности, фотохимической эффективностиФС II.

Один из распространенных флуорометрических методов заключается вопределениидолиэнергии,(фотохимическое тушение)используемойивфотохимическихэнергии, котораятеряетсявпроцессахвидетепла(нефотохимическое тушение), и на этой основе оценивать эффективностьпроцесса преобразования энергии ФАР в реакциях световой фазы фотосинтеза.Выход флуоресценции хлорофилла (φF) определяется как отношение числаиспускаемых фотонов флуоресценции к общему количеству поглощенныхквантов ФАР. Это можно рассчитать по следующей формуле: = + +,(1)где φF – квантовый выход флуоресценции; kf, kd и kp – константы скоростейизлучения квантов флуоресценции, внутренней конверсии энергии возбуждения втепло и фотохимической реакции соответственно (Shreiber et al., 1995).201.3.

Природа быстрой флуоресценции хлорофилла растенийИндукция флуоресценции хлорофилла имеет место, когда после затемненияисследуемого фотосинтезирующего объекта в течение примерно 30 минут объектосвещается (облучение в области ФАР) (Shreiber, 2004). Наблюдается внезапноеувеличение флуоресценции хлорофилл а, а затем медленное снижениеинтенсивности индуцированной флуоресценции. Это явление впервые описалКаутский в 1931 году, поэтому оно называется «эффектом Каутского».Индукционная кривая флуоресценции представляет собой изменения эмиссиифлуоресценции хлорофилла в фотосинтезирующем объекте (Strasser et al., 2010).Ее можно разделить на быструю фазу (около 1 с), которая включает в себяреакции световой фазы фотосинтеза, и медленную фазу (продолжающуюсянесколько минут), в которой доминируют процессы, связанные с регуляциейферментативных реакций по синтезу АТФ и НАДФH, необходимых дляассимиляции CO2 в строме хлоропластов (Гольцев с соавт., 2016).В темноте все фотосинтетические реакционные центры «открыты» и могутбыть возбуждены и все электронные переносчики ФС ΙΙ находятся в окисленномсостоянии (Погосян, 2006).

Это условие меняется при освещении растения. Намомент включения фотохимически активного освещения (AL, от англ. actinic light– дозa светa, которая вызывает фотохимические изменения) начинается быстраяфаза индукции флуоресценции. Интенсивность AL, как правило, определяется науровне от 200 до 500 мкмоль квантов·м–2·с–1. Даже за несколько наносекундможно регистрировать быстрое нарастание интенсивности флуоресценциихлорофилла. Измерения значения флуоресценции хлорофилла в первой точкеиндукции должны быть завершены не более чем за 40 мкс (на индукционнойкривой – точка O).

Эта величина называется начальной флуоресценцией (FO),которая в основном связана с потерями энергии в процессе ее переноса попигментной антенне к реакционному центру ФС ΙΙ. Увеличение выходафлуоресценции хлорофилла от FО до FP проходит в несколько этапов и зависит от21правильного функционирования акцепторов и доноров электронного транспорта вФС ΙΙ и эффективности взаимодействия между фотосинтетическими единицами,что определяет возможность переноса энергии возбуждения между соседнимиреакционными центрами (Маторин, Алексеев, 2013).В результате разделения зарядов в возбужденном реакционном центре ФС ΙΙвысокоэнергетические электроны восстанавливают феофитин (Фео–), первичныйакцептор фотосистемы ΙΙ (Корнеев, 2002).

От Фео– электрон переносится к QA(пластохинону, ассоциированному с D2-белком на участке QA) – первомустабильному акцептору ФС ΙΙ. После 2 ÷ 5 мс освещения исследуемого объектаредукцияакцепторазаканчивается(переходитвQA–)иинтенсивностьфлуоресценции увеличивается до уровня в точке I. Краткосрочное снижениеинтенсивности флуоресценции от I к точке D, вероятно, отражает реокислениеQA– от QB (и далее – остальной частью цепи электронного транспорта), что даетвозможность возбужденному ФС ΙΙ центру донировать следующий электрон Фeoи QA (Рисунок 6).Рисунок6.Типичныйвидиндукционнойкривойфлуоресценциихлорофилла.

Последовательные фазы индукции флуоресценции хлорофиллаобозначены буквами около кривой O, I, D, P, S, M и T (Гольцев с соавт., 2014).22Во время постепенного восстановления следующих акцепторов в электронтранспортной цепи (подвижный ПХ, цитохромный b6f-комплекс и акцепторы ФСΙ) интенсивность флуоресценции хлорофилла увеличивается от D до P, этотпроцесс длится от 0,5 секунд до 1 секунды (Strasser et al., 2004).

Флуоресценциядостигает своего максимума (FP) в точке P, что соответствует (при даннойинтенсивности AL) достижению максимальной восстановлености акцепторов ФСΙΙ и самому низкому выходу фотохимических реакций (Рисунок 6). Площадь надкривой быстрой фазы индукции флуоресценции хлорофилла (заштрихованаячасть на рисунке 6, AM) свидетельствует о количестве доступных акцепторовэлектрона в ФС ΙΙ (Маторин, Рубин, 2012). В фазе между точками P и Sнаблюдается некоторый спад флуоресценции, который связывают с ускореннойпередачей энергии возбуждения от ФС ΙΙ к ФС Ι и увеличением концентрациипротонов во внутреннем пространстве тилакоидов (люмене) и формированиемпротонного градиента (ΔpH) между люменом и стромой хлоропластов.

Этоспособствуетинтенсификациипроцессовфотофосфорилированияистартирования темновой фазы фотосинтеза. Через несколько секунд после началаосвещения (от 5 до 9 с) интенсивность флуоресценции вновь возрастает (междуточкой S и точкой М) в связи с истощением первоначального запаса ФНР(ферредоксин-НАДФ+-редуктазы) и замедления скорости восстановления НАДФ+.Через несколько секунд (от 3 до 5 с) увеличение продукции АТФ и ФНР исвязанное с ними производство восстановленного НАДФН снова приводит кснижению флуоресценции хлорофилла, которая продолжается от 100 до 240 с,пока не достигнет своего стационарного выхода – точки T (от англ.

terminalfluorescence level). Время, необходимое для достижения этого уровня, сильнозависит от физиологического состояния растений и стадии его развития.Достижение стационарного уровня излучения флуоресценции хлорофиллауказывает на то, что достигнуто равновесие между производством соединений,обладающих высокой свободной энергией (НАДФН и АТФ) в фотохимическихреакциях световой фазы, и использованием этих продуктов в биохимическихреакциях темновой фазы (Гольцев с соавт., 2016).231.4. Природа замедленной флуоресценции хлорофилла растенийЯвление замедленной флуоресценции (ЗФ) состоит в том, что послесветового возбуждения в фотосинтезирующих клетках наблюдается слабоедлительно затухающее красное свечение, испускаемое хлорофиллом (Рубин,2013).

Это свечение возникает уже после прекращения флуоресценции (FО) засчет энергии, выделяемой в ходе темновых реакций первичных фотопродуктовфотосинтеза в реакционном центре. Различие между быстрой и замедленнойфлуоресценцией связано с природой возбуждения излучающей молекулыхлорофилла. Быстрая флуоресценция связана с процессами дезактивациивозбуждения хлорофилла перед разделением зарядов в реакционном центре, тогдакак ЗФ возникает после первичного акта фотосинтеза и энергия появляется врезультате обратной рекомбинации разделенных зарядов. В процессе быстройфлуоресценции излучается 2–3 % поглощенной энергии, тогда как выход ЗФсоставляет только 0,03 % и менее от испускаемой флуоресценции (Маторин,Рубин, 2012).Досихпорнетобщепринятойноменклатурыдляописанияхарактеристических точек ЗФ во время индукционного перехода, а также нет иоднозначной интерпретации механизмов формирования максимумов на ИК(Гольцев с соавт., 2014).