Диссертация (Оценка воздействия потенциальных загрязнителей на световые реакции фотосинтеза в присутствии гуминовых веществ), страница 9

Известно, что НЧ серебра ведут кобразованию свободных радикалов в микроорганизмах и ингибируют клеточныефункций (Kim et al., 2007). Окислительный стресс является важным показателемтоксического действия НЧ серебра (Nel et al., 2006). Окислительный стресс,вызванный НЧ серебра, наблюдался у различных организмов (Ahamed et al., 2010;Choi et al., 2010; Kim et al., 2009), НЧ серебра ингибировали реакции ФС IIпресноводной водоросли Chlamydomonas reinhardtii (Navarro et al., 2008).

Хотя НЧсеребра и высокотоксичны для водных организмов, пока нет единого мнения отом, чем обусловлена данная токсичность: исключительно выделяемыми ионамисеребра или же активными формами кислорода (Juganson et al., 2017).54ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ2.1. Материалы исследованияОбъектами исследования служили рекомендованные в биотестированиикультуры морской одноклеточной диатомовой микроводоросли — Phaeodactylum.tricornutum, одноклеточные зеленые микроводоросли Scenedesmus quadricauda,растения пшеницы Triticum aestivum L (Жмур, 1997).Культивирование микроводорослей и высших растений.Культура морской одноклеточной диатомовой микроводоросли — P.tricornutum,изколлекциикафедрыгидробиологииМГУ,выделенаизфитопланктона Черного моря.

Культуру выращивали на искусственной морскойводе питательной среды Гольдберга в модификации Кабановой с концентрациейсоли 20 г/л, при температуре 20C ± 2C и освещенностью 30 мкмоль квантов·м-1·с-2, 16 ч в сутки. Культура одноклеточной пресноводной микроводорослиScenedesmusquadricaudaвыращенанасредеУспенского-1.Доначалаэкспериментов микроводоросли культивировали при температуре 24°±2C припериодическом освещении (12 часов свет 30 мкмоль квантов·м-1·с-2, 12 часовтемнота).

После добавления токсикантов и ГВ микроводоросли экспонировали втех же условиях, что и при выращивании культуры. Концентрация клеток переддобавлением препаратов, в стационарной фазе, составляла 106 кл/мл.Численность микроводорослей определялась микроскопически методомпрямого счета в камере Горяева (V=0,0001 мл) при трехкратном ее заполнении.Семена мягкой пшеницы Triticum aestivum L. проращивали в темноте при24C. После 72 ч, проростки были перемещены в 0,5 л полиэтиленовые емкости,содержащие питательный раствор Кнопа (pH 5.5) и затем выращены ввегетационной камере (фотопериод 12 ч день/12 ч ночь, освещенность 200 мкмольквантов·м-1·с-2; температура 24C).

Далее корни растений промывались вдистиллированной воде, затем растения были перенесены на 72 ч в пробирки,содержащие ДНА и ГВ.55Токсиканты и гуминовые вещества, использованные в лабораторныхисследованиях.В качестве токсикантов использовали шестивалентный хром (K2Cr2O7) вконцентрациях от 2,5 до 25 мг/л; препарат НЧ серебра в концентрациях от 0,1 до10 мг/л (“Sigma Inc.”, США); ДНА в концентрациях 15 мг/л (Синта, Беларусь).Средний размер НЧ серебра составил около 80±13 нм. Средний размер ДНА 150нм.Меченные тритием ДНА получены на химическом факультете МГУ ипредоставлены Бадун Г.А. (Badun et al., 2014). Определение ξ - потенциалапроводилось на химическом факультете под руководством Волкова Д.С.

(Volkovet al., 2012).В работе были использованы гуминовые препараты чернозема Курскойобласти, ГВ дерново-подзолистых почв территории ЗБС МГУ, ГВ реки Суванни(стандартные образцы международного гуминового общества), ГВ торфа и ГКугля. Концентрация препаратов ГВ составляла от 10 до 50 мг/л. Все образцы ГВ иих физико-химические свойства (Таблица 1) были любезно предоставленыкоординатором российского отделения Международного Гуминового сообщества(IHSS, США), проф. И. В. Перминовой (химический факультет МГУ).Измерений проводились в пятикратной повторности. Перед измерением всеобразцы выдерживались в темноте в течение 30 минут.Таблица 1.

Элементный состав препаратов ГВ (Chernysheva et al., 2016).Образец ГВГК черноземных почвФК черноземных почвГК угляГК реки СуванниФК реки СуванниГК торфаФК торфаO/C0,50,60,500,600,620,500,67Атомные отношенияH/C0,71,00,870,970,990,931,02C/N14,516,45352915728562.2. Методы исследования2.2.1. Регистрация световых кривых фотохимического инефотохимического тушения на флуориметре Water-PAMИзмерение световых реакций фотосинтеза проводили на трех флуориметрах,описанных ниже. Обобщенные показатели флуоресценции приведены в целомряде обзоров (Гольцев c соавт., 2014; Маторин, Алексеев, 2013; Маторин, Рубин,2012; Schreiber et al., 1995; Strasser et.

al., 2010).Импульсный флуориметр Water-PAM (Walz, Effelrich, Германия) привысокой чувствительности позволяет измерять световые зависимости параметровфлуоресценции у микроводорослей и определять скорость нециклическоготранспорта электронов (Рисунок 15).Рисунок 15. Внешний вид импульсного флуориметра Water-PAM.Сначала измеряется уровень F0 у выдержанного в темноте образца приоткрытых реакционных центрах. Затем подается один импульс насыщающегосвета 0,8 с, который закрывает реакционные центры и убирает фотохимическоетушение.

При этом режиме регистрируют максимальную флуоресценцию Fm. Этидва уровня задают максимальную величину переменной флуоресценции Fv = Fm F0 (2).57Через некоторое время включается постоянный действующий свет, которыйиндуцирует изменение выхода флуоресценции, характерного для обычнойиндукционной кривой флуоресценции хлорофилла F(t). При этом на всемпротяжении индукционной кривой переменная величина F(t) остается меньше, чемFm. Разница между Fm и F(t) характеризует общее тушение флуоресценции,которое развивается под действием постоянного света.

Общее тушениефлуоресценциискладываетсяизфотохимическогоинефотохимическоготушения. Во время действия насыщающей вспышки фотохимическое тушениеснимается, и флуоресценция возрастает до значения Fm´. Однако значение Fm´остается меньше, чем Fm. Так как в обоих случаях фотохимическое тушениеотсутствует, разница между (Fm - Fm´) характеризует величину нефотохимическоготушения, индукцированного постоянным освещением. Соответственно, разница(Fm- Ft´) характеризует величину фотохимического тушения и пропорциональноколичеству фотосинтетических активных центров ФС II на этом свету (Schreiberet al., 1995).Измеренияфлуоресценциибыстрыхсветовыхнапроводитсясветузависимостейприразличныхпараметровпоследовательномувеличенииинтенсивности от 0 до 2000 мкмоль квантов·м-1·с-2 и выше.

Время освещениясоставляет 10 секунд. В конце каждого сеанса освещения при определеннойинтенсивности с использованием насыщающей вспышки (0,8 с, 3000 мкмольквантов·м-1·с-2) регистрируются параметры Fm´ и выход флуоресценции на светуF(t). На основании измеренных уровней флуоресценции рассчитывали следующиепараметры: FV/FМ = (FM – FO)/FM (3) - максимальный квантовый выход разделениязарядов в ФС II; Y = (FM' – Ft)/FM' (7) - эффективный квантовый выход в ФС II насвету; NPQ = (FM – FM')/FM' (5) - нефотохимическое тушение флуоресценции.Скорость транспорта электронов рассчитывали по формуле:ETR = Y · Ei, · 0,5,(8)где Ei – освещенность, (мкмоль квантов·м-1·с-2).

На основании полученныхсветовых кривых (Р/Е кривых) оценивали следующие фотосинтетическиепараметры: коэффициент максимальной утилизации световой энергии (угол58наклона Р/Е кривой, α), максимальную относительную скорость электронов поэлектрон транспортной цепи (ETRmax) и насыщающую интенсивность света (Ен). αрассчитывали как коэффициент линейной регрессии, построенной по точкам,лежащим на светолимитированном участке Р/Е кривой, ETRmax - как среднее позначениям ETR, находящимся на светонасыщающем участке (Jassby, Platt, 1976).Ен рассчитывали по формуле:Ен = ETRmax / α(9)Обозначения и определения фотосинтетических параметров приведены всоответствии с общепринятой номенклатурой (Platt et al., 1977; Schreiber et al.,1995; Van Kooten, Snel, 1990).592.2.2.

Регистрация флуоресценции хлорофилла на флуориметре AquapenC 100Для измерения параметров индукции быстрой флуоресценции(БФ)микроводорослей использовали портативный флуориметр прибор Aqua-Pen(Photon Systems Instruments, Чехия). Прибор измеряет индукционную кривую(OJIP) БФ в мс интервале времени после включения красного света (Рисунок 16).Возбуждение красным измеряющим светом важно для работы с образцами,содержащими ГВ, которые имеют большое фоновое свечение при возбуждениисиним светом. Измерения проводили на интактных клетках в кюветах. Передизмерением образцы выдерживали 15 минут в темноте (Shreiber, 2004).Рисунок 16. Внешний вид импульсного флуориметра AquaPen.ИндукционнаяпереносчиковвкриваяБФотражаетэлектрон-транспортнойпостепенноецепи.восстановлениеИндукционныекривыефлуоресценции анализировали с помощью JIP-теста (Маторин, Рубин, 2012;Strasser et al., 2004). JIP-тест использует следующие параметры кривой индукциифлуоресценции: интенсивность при 20 мкс (FO), 2 мс (FJ), 30 мс (FI), 6 с (F6s), атакже FP (FM, максимальная интенсивность флуоресценции) и M O (площадь надкинетической кривой OJIP, но ниже уровня FM).

Эти измеряемые величиныиспользовали для расчета следующих параметров. FV = FM – FO (2) - максимальнаяпеременная флуоресценция. FV/FM - максимальный квантовый выход первичнойфотохимической реакции. FV/FО - характеризует изменения в эффективности60расщепления воды (выделения кислорода) в ФС ΙΙ. Относительная амплитуда O-Jфазы, отражающая количество закрытых РЦ по отношению к общему числу РЦ,которые могут быть закрыты:VJ = (FJ – FO)/FV(10)Относительная амплитуда J-I фазы, которая отражает способность ФС I и ееакцепторов окислять пул пластохинонов:VI = (FI – FО)/FV(11)Параметр, указывающий на нарушения в процессе разложения воды:VK = (FK – FO)/FV(12)Начальный наклон фазы O-J роста флуоресценции:MO = 4·(F300мкс – FO)/FV(13)Поток энергии, поглощаемый одним активным РЦ:ABS/RC = MO(1/VJ)(1/φPo)(14)Поток электронов, переносимых через один активный реакционный центр(РЦ):ETO/RC = MO(1/VJ)(15)Общее количество энергии, рассеиваемой одним РЦ в виде тепла:DlO/RC = (ABS/RC) –TRO/RC(16)Поток энергии возбуждения, улавливаемой одним РЦ в начальный моментосвещения адаптированного к темноте объекта:TRO/RC = MO(1/VJ)(17)Вероятность транспорта электронов за пределы QA, эффективность, скоторой экситон, захваченный РЦ, движет электрон по цепочке после QA:ψ0 = ETO/TRO = (1 – VJ)(18)Квантовая эффективность переноса электронов от QA:φEo= ETO/ABS= φPoψ0(19)Обобщающий показатель функциональной активности ФС II:PIABS = (RC/ABS) (φPo/(1 – φPo))(ψ0/(1 – ψ0)ΔpH-зависимое нефотохимическое тушение:(20)61qE = (FM – F6s)/FV(21)622.2.3.