Диссертация (Оценка воздействия потенциальных загрязнителей на световые реакции фотосинтеза в присутствии гуминовых веществ), страница 10

Регистрация индукционных кривых быстрой, замедленнойфлуоресценции и редокс превращения Р700 (пигмент ФС I) на М-РЕА-2МногофункциональныйанализаторM-PEA-2(HansatechInstruments,Великобритания) наряду с регистрацией флуоресценции микроводорослей илистьев растений может измерять изменения поглощения Р 700 (пигмента ФС I)(Гольцев с соавт., 2014). Прибор позволяет одновременно следить за отдельнымиреакциями ФС I и ФС II. Кроме того, прибор регистрирует индукционныеизменения замедленной флуоресценции (ЗФ), которые дают информацию окинетикеэлектрохимическогоградиентапротоновнафотосинтетическойР700+мембране. Типичные кривые приведены на рисунке 17.Время освещения, мсРисунок 17. Индукционные кривые БФ (кривая 1) и ЗФ (кривая 2) имодулированного рассеивания света с длиной волны 820 нм (кривая 3) послеосвещения листовых пластинок пшеницы, адаптированных в течение 1 часа втемноте. Стрелками указаны характеристические точки индукционных кривых.Индукционные кривые были одновременно измерены на приборе M-PEA-2.Регистрациюфлуоресценциихлорофиллаапроводилипозаранееустановленным протоколам измерения.

Флуоресценцию хлорофилла а иизменение рассеяния света при длине волны 820 нм индуцировали краснымсветом (625 нм ± 10 нм) с интенсивностью 1500 (для микроводорослей) или 500063(длявысшихрастений)мкмольквантов·м-2·с-1втечение60с.ЗФрегистрировалась в режиме «Multi», т.е. в режиме чередования освещения светтемнота. На рисунке 18 представлен внешний вид M-PEA-2.БАРисунок 18. Внешний вид флуориметра M-PEA-2 (А). Оптический блок MPEA-2 (Б): (1) – эмиттер 820 нм Р700+, (2) – детектор Р700+, (3) – детектор БФ, (4)– детектор ЗФ, (5) – детектор оптической плотности, (6) – эмиттер дальнегокрасного света, (7) – эмиттер актиничного (действующего) света (http://hansatechinstruments.com).Три эмиттера (генераторы излучения) и четыре собирающих детекторавстроены в датчик M-PEA.

Длины волн эмиттера составляют 627±10 нм для LED(светодиод)актиничногосвета,820±25нмдляLEDмодулированного(регулируемого) света и 735±15 нм для LED для дальнего красного света.Светодиод действующего красного света встроен в центре оптического элементадатчика и фокусируется на поверхности образца, чтобы обеспечить равномерноеосвещение, с интенсивностью до 5000 мкмоль квантов·м-1с-2при 100%. Другиеизлучатели и детекторы встроены по периферии устройства.Регистрация быстрой и замедленной флуоресценции производится причередовании действующего красного и темновых интервалов. Прибор измеряетиндукционные кинетики с высоким разрешением (начиная с 0,02 мс), адлительность темновых интервалов может составлять 0,1 мс, актиничноеосвещение может быть прервано в любое время в ходе индукции флуоресценции(при записи до 300 с), а самый ранний темновой интервал может включить при 0,364мс.

Одновременные измерения БФ и ЗФ требуют чередования световых итемновых интервалов, где БФ регистрируется во время JIP, а ЗФ в период временизадержки. Характеристики и протокол измерений на приборе M-PEA-2 былиподробно описаны (Маторин, Рубин, 2012; Bulychev et al., 2013; Goltsev et al.,2009; Strasser et al., 2010). Для измерения флуоресценции хлорофилламикроводоросли осаждали на фильтрах, а листья растений помещали вспециальные клипсы.652.2.4.

Регистрация кинетики окисления и восстановления пигмента Р700реакционного центра ФС I.Для более полного представления кинетики окисления и восстановленияР700, пигмента ФС I, на кафедре биофизики МГУ была использована специальнаяустановка, которая позволяет с высокой чувствительностью регистрироватьизменения пропускания при 820 нм, составляющие всего 10-5 (Solovchenko et al.,2015).

Прибор представляет собой быстродействующий двуволновой фотометр.На объект (кювета с оптическим путем 1 мм) направлены два пучка от двухразных светоизлучающих диодов. Максимум излучения одного диода находитсяна длине волны 830 нм, другого – на 900 нм. Диоды включаются попеременно. Ихизлучение не поглощается фотосинтетическими пигментами и потому не влияетна фотосинтетический электронный транспорт, создаваемый ФС I и ФС II.С противоположной стороны от объекта находится фотодиод, которыйявляется детектором прошедшего через образец излучения с длинами волн 830 нми 900 нм. Перед детектором установлен светофильтр, пропускающий свет сдлиной волны более 800 нм. Количество окисленного P700 в каждый моментвремени определяется следующим выражением:[P700+] =I 900  I 830,I 900(22)где I900 и I830 - интенсивности прошедших через образец световых пучков сдлинами волн 900 нм и 830 нм.Канал 900 нм является опорным, он необходим для контроля тех изменений всветопропускании объекта, которые не связаны с образованием P700+.

Онипроисходят за счет изменения светорассеяния образца в процессе оседания клетоки в процессе их облучения. Важным свойством светорассеяния является то, чтооно будет практически идентичным в обоих спектральных каналах (830 нм и 900нм). Поэтому изменения светорассеяния объекта в процессе измерений66эффективно подавляются системой дифференциальной регистрации пропусканияна двух близких длинах волн.Фотоокисление P700 индуцируется источником актиничного света (700 нм,5000 мкмоль квантов∙м-2·с-1), направленным в ту же область, через которуюпроходит тестирующее инфракрасное излучение 830/900 нм. Актиничный свет ивозбуждаемая им флуоресценция хлорофилла имеют длину волны менее 800 нм, апотому не попадают на детектор и не мешают определению пропускания надлинах волн 830/900 нм.Актиничный свет включается на время 5 мс.

В течение этого времени в ФС Iпроисходит накопление окисленного P700 и увеличение экспериментальногосигнала I900 - I830. В это же время ФС II производит фотохимическоевосстановлениепулахинонов.Послеотключенияактиничногосветафотоокисление P700 прекращается и начинается его восстановление (спад I900 I830) электронами, поступающими из пула хинонов через цитохромный b6fкомплекс и пластоцианин.

Обычно восстановлениеP700 происходит схарактерным временем порядка 10-20 мс, однако в неблагоприятных условияхэтот процесс может растягиваться до 200 и более миллисекунд.672.2.5. Спектральный анализСпектральный анализ проводили на приборе с интегрирующей сферой набазе спектрометра USB2000 (Ocean Optics, США), разработанный на кафедребиофизики биологического факультета МГУ и на спектрофотометре HITACHI557 (Япония). Спектры испускания, спектры возбуждения флуоресценции изатухание флуоресценции регистрировали с помощью спектрофлуориметраFluorolog-3 (Horiba Jobin Yvon).Вкачествеисточникасветабылаиспользованагалогеннаялампаноминальной мощностью 100 Вт, стабилизированная по току.

Для полученияболее равномерного спектра излучения по всему диапазону (380 нм – 800 нм)использованы корректирующие светофильтры. Спектры поглощения суспензииизмеряют в кварцевой кювете с оптическим путем 1 см.Информация о спектре света, прошедшего через объект, поступает от блокаспектрометра в персональный компьютер и обрабатывается с помощьюприложенного к спектрометру программы. Для снижения ошибки в определенииспектров поглощения, обусловленной перемещением агрегатов клеток в пределахизмерительного светового пучка, использовано программное накопление 100спектров с последующей статистической обработкой результатов. Допустимаяпогрешность измерения оптической плотности не должна превышать 0,005 приоптической плотности 1 во всем спектральном диапазоне.Собрать рассеянный свет полностью и направить его на детектор, какправило, не удается.

В данной задаче для определения истинного поглощенияиспользован специальный алгоритм, предполагающий измерение двух спектровослабления на разном удалении кюветы от интегрирующей сферы. Вспектрофотометрепредусмотренавозможностьустановкикюветывсоответствующих двух фиксированных положениях. Спектры ослабления светасуспензией клеток – A1(λ) и A2(λ) определяются как:68A   log 10I o  ,I  (23)где Io(λ) - спектральная плотность светового потока, прошедшего через образецсравнения;I(λ) - спектральная плотность светового потока, прошедшего через образец cклетками водорослей;A1(λ) – спектр ослабления света, записанный при минимально возможномрасстоянии между кюветой и интегрирующей сферой;A2(λ) – спектр ослабления света, записанный при удалении кюветы отинтегрирующей сферы на 3 мм.Из спектров A1(λ) и A2(λ) рассчитывают спектр поглощения суспензииводорослей по следующей формуле (Solovchenko et.

al., 2015):Dсусп(λ) = A2(λ) – A2(800 нм) · (A2(λ) – A1(λ)) / (A2(800 нм) – A1(800 нм))(24)692.2.6. Определение размера наночастицОпределение размера наночастиц серебра и ДНА и дзета-потенциала ДНАпроводили методом динамического светорассеяния с использованием анализатораZetaSizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Великобритания) на химическомфакультете МГУ (Volkov et al., 2012).2.2.7. Программное обеспечениеИзмеренныесигналыфлуоресценцииобрабатываливпрограммномобеспечении M-PEA-data-analyzer V.5.2 (София, Болгария). Расчеты выполнялисьс применением пакета Microsoft Excel 2010 (Microsoft Corporation, США). Дляпостроения графиков использовали пакет Origin v. 9.1 (OriginLab Corporation,США).

Статистические расчеты проведены с помощью пакета Statistica v.10(StatSoft, Inc., США). Проверка статистических гипотез на сравнение двухнезависимых выборок осуществлялась непараметрическим критерием MаннаУитни, уровень значимости принят за P<0,05. А также спомощью методагруппирования выборок с наименее значимой разницей - LSD (α = 0,05).70ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ3.1. Оценка влияния гуминовых веществ на световые реакции фотосинтезазеленых микроводорослей Scenedesmus quadricaudaГуминовые вещества (ГВ) играют важную роль в экологическом равновесииприроды. ГВ выполняют ряд важных экологических функций в биосфере:аккумулятивную, транспортную, регуляторную, физиологическую и защитную.