Диссертация (Аргоноплазменная энергия в лечении доброкачественных опухолей и опухолевидных образований яичников), страница 4

Забор кровипроводили утром строго натощак, у курящих пациенток - до первого курения.20Контроль ПДТ производили до операции, спустя 6-12 часов, 72-96 часа и на5-7 сутки после операции.Материалом для определения уровня СРБ стала сыворотка крови.Определение СРБ в сыворотке крови основано на методе твердофазногонепрямого ИФА на реактивах фирмы «DiaSys™» (ФРГ). В реактивах имеютсямоноклональные антитела, соединяющиеся с антигенной детерминантой вструктуре молекулы СРБ. Эти моноклональные антитела адсорбированы в лункахстандартного микропланшета.

Метод твердофазного непрямого ИФА основан наобразовании «сэндвича» при внесении стандартных контролей и разведенныхисследуемых сывороток в микропланшет. Присутствующий СРБ сразу связывалсяс иммобилизированными антителами и конъюгатом. Микропланшеты помещали винкубатор и через 45 минут не связавшиеся меченные антитела удалялипромывкой.Добавлениесубстрататетраметилбензидинаи20-минутнаяинкубация приводили к появлению голубой окраски, которая останавливаласьдобавлением однонормального раствора соляной кислоты, при этом цветисследуемого раствора менялся с голубого на жёлтый. На спектрофотометре придлине волны 450 нм измеряли интенсивности окраски, которая прямопропорциональна концентрации СРБ в рабочем растворе.Определение МСМ проводили в сыворотке крови с применениемскринингового метода [11].

Первоначально из сыворотки крови убираливысокомолекулярные белковые продукты путем химической денатурации спомощью 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Получаемый кислотный элюатпредставляетсобойгрубуюилинеочищеннуюфракциюМСМ,ноприсутствующие соединения в силу используемого метода определения неоказываетвлияниянавеличинуполучаемойконцентрацииМСМ[11].Центрифугировали при 3000 об/мин после добавления к биологическомусубстрату трихлоруксусной кислоты на протяжении 30 минут. Оптическуюплотность (ОП) полученного надосадка, разведенного в 9 раз дистиллированнойводой, измеряли при длинах волн 254 и 280 нм на спектрофотометре в сравнениис дистиллированной водой. Разведённый надосадок и дистиллированную воду21наливали в кюветы с длиной оптического пути 10 мм. Величину МСМ измеряли вединицах показаний спектрофотометра.Значения суммарной КФНК определяли после центрифугирования крови сполучением сыворотки.Кислотоэкстрагируемая часть нуклеиновых кислот обладает свойствомпоглощения света в ультрафиолетовом спектре.

Степень выраженности некрозатравмированных тканей, по предложению В.А. Бурлева и соавт. [11], предложеноопределять с помощью спектрофотометра поглощением ультрафиолетовогоизлучения суммарной КФНК после извлечения из сыворотки крови. Определениесуммарной КФНК сыворотки крови с помощью спектрофотометра названоавторами «методом выявления некроза тканей». Сыворотку вносили в 5% растворсоляной кислоты в соотношении 1:40. После добавления соляной кислотыпроизводили 5-минутную инкубацию и центрифугирование при комнатнойтемпературе при 3000 об/мин. Надосадочной элюант помещали в 10миллиметровуюкварцевуюкюветудляизмеренияпоглощенияультрафиолетового излучения в сравнении с 5% раствором хлорной кислоты придлинах волн 260 и 320 нм. Спектр поглощения кислотоэкстрагируемыхкомпонентов КФНК имеет максимум при длине волны 260 нм, а при длине волны320 нм поглощение минимально.

Разность между величинами поглощения приэтих длинах волн служила количественной характеристикой нуклеотидногоматериала (КФНК), при этом количество КФНК выражалось в единицах ОП (260320) на 1 мл сыворотки крови.ТБК-ап определяли в сыворотке крови по методу K. Jagi в модификацииМ. Ishihara [118].

МДА – конечный продукт перекисного окисления липидов,определяемый в реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой в сыворотке крови дляоценки травматизации тканей. Такие низкомолекулярные соединения как сахара,сиаловые кислоты, некоторые аминокислоты наряду с МДА могут образовыватьокрашенные соединения с ТБК, то есть в конечном итоге определяется суммаТБК–активных продуктов. Рабочий раствор помещали в кварцевые кюветы сдлиной оптического пути 10 мм и измеряли ОП при длине волны 532 нм22спектрофотометрическивсравнениисдистиллированнойводой.Расчетколичества МДА проводили с учетом разведения по формуле:C=E/U,где Е – оптическая плотность пробы; U – молекулярный коэффициент гашения,равный 1,56х10-5 моль-1см-1; C – концентрация МДА, выраженная в мкмолях на1 мл сыворотки.Для расчёта эндотоксического индекса изначально на биохимическоманализаторе «Ultra» (фирма «KOHE™», Финляндия) определяли уровень АсАТ,общего белка и мочевины.Уровень общего белка сыворотки крови определяли унифицированнымметодом, основанным на биуретовой реакции — белки сыворотки кровиреагируют с сульфатом меди, при этом образуя соединения, окрашенные вфиолетовый цвет.Ход работы: в первую пробирку вносили 0,1 мл 0,9% раствора натрияхлорида (контроль), во вторую — 0,1 мл стандартного раствора белка (50 г/л), втретью пробирку — 0,1 мл исследуемой сыворотки крови.

Во все пробиркидобавляли по 5 мл биуретового реактива, перемешивали содержимое пробирок,через 30 минут определяли экстинкцию (кювета 10 мм, красный светофильтр750 нм) против контроля.Расчет проводили по формуле:Х =а × b/с,где Х – концентрация белка в исследуемой сыворотке крови, г/л;а – концентрация белка стандартного раствора белка;b – экстинкция исследуемой сыворотки крови;с – экстинкция стандартного раствора белка.Дляопределениямочевинывсывороткекровииспользовалиферментативный (уреазный) тест.

Принцип метода заключается в том, чтомочевина под действием уреазы разлагается на углекислый газ и аммиак, которыйв щелочной среде с гипохлоритом натрия и фенолом образует индофенол синего23цвета(методБертло).Светопоглощениеобразовавшегосяпродуктапропорционально содержанию мочевины в образце.Ход работы: перед определением сыворотку разводили 0,154 моль/лраствором хлорида натрия в соотношении 1:9. Опытная проба: 100 мкл рабочегораствора уреазы вносили в пробирку, добавляли 20 мкл разведенной сыворотки.Закрывали пробкой, перемешивали и инкубировали в течение 15 минут притемпературе 37°С.

После инкубации добавляли 300 мкл цветного реактива и300 мкл рабочего раствора гипохлорита натрия. Перемешивали и инкубировали втечение 20–30 минут при температуре 37°С. Измеряли экстинкцию в кювете столщиной слоя в 1 см при длине волны 500–560 нм (зеленый светофильтр) противхолостой пробы. Окраска стабильна в течение нескольких часов. Холостую пробуобрабатывали так же, как опытную, но вместо сыворотки брали 0,154 ммоль/лраствор натрия хлорида.

Калибровочную пробу обрабатывали так же, какопытную, но вместо сыворотки брали калибровочный раствор мочевины.Измеряли при тех же условиях против холостой пробы.Расчет количества мочевины в ммоль/л проводили по формуле:Еоп / Ек × 0,5 × 10,где Еоп – экстинкция опытной пробы;Ек – экстинция калибровочной пробы;0,5 — концентрация мочевины в калибровочном растворе, ммоль/л;10 — коэффициент разведения.Линейная зависимость между ОП и концентрацией мочевины сохраняетсядо 33 ммоль/л.АсАТ катализирует реакцию между L-аспартатом и 2-оксоглутаратом, врезультате которой они превращаются в L-глутамат и оксалацетат. Определениеосновано на измерении ОП гидразонов 2-оксоглутаровой и пировинограднойкислоты в щелочной среде. Гидразон пировиноградной кислоты, возникающийпри самопроизвольном декарбоксилировании оксалацетата, обладает болеевысокой ОП.24Ход работы: перед определением температура растворов и сывороткидолжна быть доведена до температуры измерения.

Перед работой можно готовитьсмесь реактивов, состоящую из субстратно-буферного раствора, раствораникотинамидадениндинуклеотида(НАДН),малатдегидрогеназы,лактатдегидрогеназы в соотношении 60:1:1:1. Определение проводили последующей схеме. Перемешивали и через 60 с (лаг-фаза) измеряли экстинкцию иодновременно включали секундомер. Точно через 1, 2, 3 минуты (или через болеекороткие, но равные промежутки времени) измеряли экстинкцию.Поправку на холостой опыт проводили по формуле:(ΔΕ/Δt)оп – (ΔΕ/Δt)хол = (ΔΕ/Δt)скор.Расчет производили по формуле:Активность, моль/(с∙м³) = н моль/(с∙л) ґ 106 = Vр.с / ε ґ 1∙Vсыв ґ (ΔΕ / Δt)скор,где Vр.с — объём реакционной смеси, мл;Vсыв — объём сыворотки, мл;t — время реакции, сек.;ΔΕ / Δt — изменение экстинкции за 1 с;ε — коэффициент молярной экстинкции НАДН в м² ґ моль–1;1 — толщина слоя жидкости в кювете в метрах (1∙10²).Показатели ЭТИ рассчитывали по формуле:Определение ЭТИ проводили в динамике: до операции, спустя 6-12 ч, 7296 ч и на 5-7 сутки после операции.

Четырежды производили расчет ЭТИ как дооперативного вмешательства, так и после — через 6-12 ч, 72-96 ч и на 5-7 сутки.Гормональноеобследованиепроводиливпредоперационномивпослеоперационном периоде через 3, 6, 12 месяцев. Оно включало изучениеантимюллерова гормона (АМГ), базальный уровень фолликулостимулирующегогормона (ФСГ), ингибина В. Метод основан на твердофазном ИФА (ELISA) ииспользуется для количественного определения в сыворотке крови после25центрифугирования.