Диссертация (Роль нарушения оксидативного статуса у больных системной красной волчанкой в развитии факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний), страница 4

Данные биомаркёры также могут служитьпотенциальнымисуррогатнымиточкамиприоценкеклиническойэффективности новых лекарственных средств. Их можно классифицировать в21зависимости от типа биомолекулы, подвергшейся окислению: продуктыокисления липидов (малоновый диальдегид (МДА), F2-изопростан, 4гидрокси-2-ноненаль), белков (нитротирозин, карбонильные производные) инуклеиновых кислот (8-гидроксидезоксигуанозин) [24].Продукты окисления липидовОценкасодержанияПОЛ основана, главным образом, на методах анализаустойчивыхпобочныхиконечныхпродуктовреакцийпревращения и разрушения гидроперекисей.МДА представляет собой побочный продукт метаболизма арахидоновойкислотыиконечныйпродуктокислительногоповреждениядругихненасыщенных жирных кислот. При высокой концентрации МДА образуютсвязи c макромолекулами: белками, фосфолипидами и нуклеиновымикислотами,продуктыэтихреакцийобладаютканцерогеннымиимутагенными свойствами.

Содержание МДА оценивают с помощью реакциистиобарбитуровойкислотой,спектрофотометрически,специфичность.недостаткомАльтернативнымвысокоэффективнаяжидкостнаяпродуктметодареакцииопределяютявляетсяметодомегоможетхроматографиянизкаяслужить(ВЭЖХ)сультрафиолетовым детектором, являющаяся более специфичным методом,тем не менее, её практическое применение в клинической практикеограничено ввиду технических сложностей, связанных с особенностямиподготовки проб, требованиями к специальному оборудованию [25].4-гидрокси-2-ноненаль является токсическим альдегидом, результатомвоздействия свободных радикалов на полиненасыщенные жирные кислоты(арахидоновую, линолевую и линоленовую кислоты).

Его концентрацияможетбытьизмеренаспомощьюВЭЖХ,газовойхромато-масс-спектрометрии, иммуноферментного анализа (ИФА) [26].F2-изопростаны представляют собой группу биологически активныхпростагландиноподобныхсоединений,образующихсяприперекисномокислении арахидоновой кислоты, вызванном свободными радикалами. Эти22соединениясчитаютспецифичныммаркёромПОЛвразличныхбиологических жидкостях, в отличие от МДА уровень F2-изопростанов независит от содержания липидов в потребляемой пище.

Концентрация F2изопростанов может быть оценена с помощью хромато-масс-спектрометриии ИФА [27, 28].Продукты окисления нуклеиновых кислотНаиболее широко применяемым маркёром окислительного поврежденияДНК является 8ОНдГ, продукт модификации азотистого основания гуанина.Его уровень можно оценить с помощью ВЭЖХ, жидкостной хроматографиис масс-спектрометрией, ИФА [29, 30].Продукты окисления белковОкислительное повреждение белков приводит к нарушению ихпервичной структуры, вызванной модификацией аминокислотных остатков,расщеплением пептидной цепи; образованию поперечных сшивок, грубымнарушениям третичной структуры.Наиболее часто используемым маркёром повреждения белков являютсяих карбонильные производные, образующиеся при прямом воздействии АФКна остатки лизина, аргинина, треонина, пролина и гистидина, при их реакциис продуктами ПОЛ или при гликоокислительной модификации лизина.Уровеньэтихсоединенийможетбытьоцененспомощьюспектрофотометрии, ВЭЖХ, вестерн-блоттинга, ИФА [31, 32].Образование нитротирозина в белковых молекулах происходит поддействием АФА, например, пероксинитрита, диоксида азота.

Уровень 3нитротирозинаможнооценитьспомощьюИФА,хромато-масс-спектрометрии, а также жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией[33].Также уровень оксидативного стресса можно оценить по состояниюантиоксидантнойсистемы:определяяактивностьантиоксидантныхферментов (СОД, каталаза и др.) или общую антиоксидантную активностьбиологических жидкостей.Так как определение одного компонента23антиоксидантнойсистемыможетбытьсвязаносопределённымиметодологическими трудностями и представляет малую информативность, тоболееширокоераспространениеполучилоизмерениеобщейантиоксидативной активности биологических жидкостей, в первую очередь,плазмы крови [15, 34, 35].Исследование уровня антиоксидантной активности (АОА) основано наоценкесоотношенияокислениясубстратареакцииокислителемвприсутствии и отсутствии антиоксиданта (исследуемого образца).

Наиболеераспространёнными методами регистрации окисления субстрата являютсяфотометрический и хемилюминесцентный методы. В качестве усилителейсвечения применяют активаторы: кумарины, люцигенин, люминол. ЗначениеАОА представляют, как правило, в единицах стандартного антиоксиданта:аскорбата натрия, водорастворимого аналога витамина Е – тролокса.Широкое распространение получил хемилюминесцентный метод оценкиАОА,сиспользованиемамидинопропан)дигидрохлоридазосоединения–2,2’-азо-бис(2-(АБАП) в качестве источника свободныхрадикалов, благодаря своей высокой чувствительности [36, 37].1.5 Оксидативный стресс и воспалениеВоспаление является естественным механизмом защиты от патогенныхмикроорганизмов и играет значительную роль в патогенезе многихзаболеваний, например, бактериальных и вирусных инфекций, аллергическихи аутоиммунных заболеваний, заболеваний, связанных с воздействиемионизирующего излучения и токсичных химических веществ, атеросклероза.Наибольшую активность на начальных этапах проявляют нейтрофилы,далее происходит рекрутинг и миграция в область воспаления других видовлейкоцитов: моноцитов, дифференцирующихся впоследствии в макрофаги, илимфоцитов.

Одним из механизмов, с помощью которого гранулоциты (впервую очередь нейтрофилы) и макрофаги осуществляют свою защитнуюфункцию, является продукция АФК в фаголизосомах под действием24НАДФН-оксидазы в ходе респираторного взрыва. Образование АФК вфагоцитах происходит в ответ на их активацию под влиянием различныхстимулов. Переход фагоцитов из начального состояния с низкой скоростьюпротекания биохимических процессов в активированное протекает черезособоепромежуточноепроисходит«праймированное»увеличениепотенциальнойсостояние,прифункциональнойкоторомактивностифагоцитов. Молекулярный механизм праймирования может быть следствиемизменения количества и аффинности рецепторов, а также пути передачивнутриклеточногосигналанаферментативныесистемы.Вролистимуляторов «прайминга» фагоцитирующих клеток могут выступать какестественные факторы, например, цитокины, компоненты бактериальнойстенки, продукты перекисного окисления липидов, так и искусственныефакторы, примером которых могут служить форбол-12-миристат-13-ацетат(ФМА) и хемоаттрактантный пептид формил-метионил-лейцил-фенилаланин(ФМЛФ).Также нейтрофилы могут захватывать и инактивировать патогенныемикроорганизмы в особых структурах – нейтрофильных внеклеточныхловушках (НВЛ), состоящих из хроматина и гранулярных антимикробныхпептидов, образующихся в ходе нетоза, одного из механизмов клеточнойсмерти, характерного для нейтрофилов [38, 39].

АФК играют ключевую рольв образовании НВЛ, так как они необходимы для высвобождения эластазы имиелопероксидазы, участвующих в деградации гистонов, из азурофильныхгранул. Образование АФК способствует активации сигнальных путей:ядерного фактора транскрипции κB (NF-κB), участвующего в регуляцииэкспрессии провоспалительных цитокинов, например, ИЛ-1β, ИЛ-6, факторанекроза опухоли α (ФНО-α) [40, 41]; киназы, активируемой внеклеточнымсигналом (ERK). Сигнальный путь ERK участвует в регуляции адаптивногоиммунитета, обеспечивая активацию Т-клеток. Кроме того, АФК способныиндуцировать экспрессию NO-синтазы и циклооксигеназы-2 [42]. Крометого, АФК участвуют в регуляции адаптивного иммунитета. АФК влияют на25активацию Т-клеток, подавляют их пролиферацию, модулируют сигнальныепути Т-клеточных рецепторов.

Было обнаружено, что подавление CD4+ Тклеток регуляторными Т-клетками находится в зависимости от продукцииАФК. Полагают, что АФК оказывают влияние на дифференцировку Т-клеток,способствуя их развитию в фенотипы Т-хелперов 1 и 17 типов. АФК могуттакже выступать в роли индукторов апоптоза Т-клеток памяти и CD4+ Тклеток, оказывая при этом ограниченное действие на Т-клетки других типов[43, 44].Помимо этого, АФК способны влиять на передачу внутриклеточногосигнала в В-клетках, например, способствуя фосфорилированию тирозина, и,как следствие, амплификации сигнала, начинающегося с активации Вклеточных рецепторов [45, 46].Многочисленные исследования подтверждают тесную взаимосвязьмежду воспалением и оксидативным стрессом. При нарушении течениявоспалительной реакциивозможнаизбыточнаяпродукцияАФК,ихдиффузия вне клетки способна вызывать локальное повреждение тканей.АФК образуются также в нефагоцитирующих клетках в ответ на действиепровоспалительных цитокинов.