Диссертация (Роль нарушения оксидативного статуса у больных системной красной волчанкой в развитии факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний), страница 9

Характеристика проводимой иммуносупрессивной терапииу 53 больных СКВ.ТерапияКоличество больных (n, %)Активная иммуносупрессивная терапия:ГКСициклофосфамидв 12 (22,6)сверхвысоких дозахПоддерживающая терапия per osГКСвсочетаниис 24 (45,3)гидроксихлорохиномМонотерапия ГКС4 (7,6)ГКС в сочетании с азатиоприном8 (15,1)ГКС в сочетании с препаратами 5 (9,4)микофеноловой кислоты2.2. Методы обследования больныхОбследованиебольныхпроводилосьпоединомупротоколу,включающему сбор анамнеза, физическое обследование и лабораторные иинструментальные исследования, консультации невролога и офтальмолога.Инструментальноеобследованиевключалоэлектрокардиографию,рентгенографию и компьютерную томографию органов грудной клетки,ультразвуковое исследование органов брюшной полости, почек, сердца, веннижних конечностей.Лабораторные исследования:1. Клинический анализ крови — подсчёт количества лейкоцитов,эритроцитов, тромбоцитов, определение концентрации гемоглобина,лейкоцитарной формулы и СОЭ — выполнен на автоматическомгематологическом анализаторе «MEK-6400 J/K» фирмы «NihonKohden corporation» (Япония).2.

Биохимический анализ крови — показателей трансаминаз (АЛТ,АСТ), ЛДГ, глюкозы, общего белка, альбумина, билирубина и его49фракций, мочевой кислоты, холестерина, липидного спектра,электролитов (К+, Na+), мочевины, креатинина — выполнен наавтоматическомбиохимическоманализатореORGENTECDiagnostika GmbH (Германия).3. Клинический анализ мочи, определение суточной протеинурии.4. Проба Реберга-Тареева.5. УровеньантителкДНКиммуноферментного анализаоценивалиприпомощи(ORGENTEC Diagnostika GmbH,Германия), антинуклеарный фактор определяли методом непрямойиммунофлуоресценции(снаборамигемолитическую активность комплементаIMMCO),общуюоценивали методомрадиальной иммунодиффузии с наборами института имени Н.Ф.Гамалея.КонцентрациювысокочувствительнымС-реактивногобелкаиммунонефелометрическимопределялиметодомслатексным усилением с помощью автоматического анализатораспецифических белков ARRAY 360 (США).

Все иммунологическиеисследования проводились согласно инструкции производителя.6. Исследование системы гемостаза с определением всех показателейплазменногоитромбоцитарногозвенавыполнялосьсиспользованием соответствующих реактивов на аппаратах фирмыCormay (Германия).2.3 Специальные методы исследованияОпределение антиоксидантной активности (АОА) плазмы кровиметодом кинетической люминол-активированной хемилюминесценцииАОА плазмы крови оценивали с помощью методики, основанной наподавлении хемилюминесценции [152]. В качестве источника свободныхрадикалов в системе использовали АБАП (Fluka, США). В качествехемилюминесцентногозондаиспользовалилюминол(5-амино-1,2,3,4-тетрагидро-1,4-фталазиндион, гидразид 3-аминофталевой кислоты, Sigma-50Aldrich, США).

Хемилюминесцентный анализ плазмы проводили наоднокюветном хемилюминометре «SmartLum 100» (ДИСофт, Россия).В кювету объемом 1,5 мл помещали 50,0 мкл 50 мМ раствора АБАП и20,0 мкл 0,1 мМ люминола. Смесь перемешивали в течение двух минут навстряхивателе «Vortex yellow line tts2» при частоте 1400 об/мин иинкубировали 20 минут в темноте при комнатной температуре.

Образованиесвободных радикалов в системе инициировали добавлением в эту кювету 920мкл нагретого (37˚С) фосфатного буферного раствора (100 мМ КН2РО4, рН7,4). Регистрировали свечение до достижения стационарного уровня (I0) при37°С, затем добавляли 10 мкл плазмы крови, предварительно разбавленной в10 раз фосфатным буферным раствором. После добавления плазмы кровисвечение прекращалось ввиду нейтрализации радикалов антиоксидантамиплазмы крови, в первую очередь, мочевой кислотой.

После истощениясодержания антиоксидантов свечение вновь увеличивалось и достигалонового стационарного уровня I. В качестве аналитического сигналаиспользовали—S(АОА)площадьнадкривой,«вырезаемую»антиоксидантами (Рис. 1).IХЛ *103, имп/с3,0I2,52,01,5I01,0S*103, имп0,50,0051015202530Время, минРисунок1.Типичнаякривая,отражающаякинетикуреакциихемилюминесценции при исследовании АОА плазмы крови. Аналитическийсигнал S(АОА) — площадь над кривой, «вырезаемая» антиоксидантами51[153].ОпределениеАОАпреднизолонаиметотрексатаметодомкинетической люминол-активированной хемилюминесценцииВэкспериментахиспользовалипрепараты:преднизолон(таблетированная форма, доза 5 мг, производитель «ГЕДЕОН РИХТЕРРУС»,Россия),метотрексат(таблетированнаяформа,доза5мг,производитель EBEWE PHARMA, Австрия). 5 мг каждого препаратаизмельчали и растворяли в 10 мл фосфатного буферного раствора. ДляопределенияАОА препаратов в систему,генерирующую радикалы,состоящую из фосфатного буфера, АБАП и люминола, объёмом 990 мкл,добавляли 10 мкл полученного раствора препарата.

Конечная концентрацияпрепарата в кювете составила 5,0 мг/л, что соответствует по порядкувеличины концентрации препарата в плазме крови при дозировке 25 мг, сучетом биодоступности препарата. Значения АОА пересчитывали в единицыаскорбиновой кислоты.Определениедолиокисленногоальбумина(ДОА)методомфлуоресценцииСпектры флуоресценции регистрировали на спектрофлуориметре RF5301PC (Shimadzu, Япония) в кварцевых кюветах с длиной оптического пути1,00 см.Из плазмы крови предварительно отделяли глобулины: к 100 мклплазмы добавляли равное количество насыщенного раствора сульфатааммония ((NH4)2SO4, Sigma-Aldrich, США), при этом глобулиновая фракцияосаждалась, а альбуминовая оставалась в растворе. Полученную смесьперемешивалинавстряхивателе,образовавшийсяосадокотделялицентрифугированием в течение 10 минут при 450 g (микроцентрифугаMiniSpin — Eppendorf, Нидерланды). Использование сульфата аммония вкачествевысаливателянепрепятствовалопроведению52спектрофлуориметрических исследований.Полученную безглобулиновую плазму предварительно разбавляли в500 раз в 100 мМ фосфатном буферном растворе (рН 7,4) и одновременнорегистрировали спектр флуоресценции и спектр поглощения.

Для расчетаДОА использовали формулу [154]:,где I — флуоресценция альбумина в исследуемой плазме (λ ex = 260 нм,λfl = 335 нм), I0 — флуоресценция чистого альбумина в концентрации вплазме, определенной биохимическим методом.Осаждение ЦИК и определение показателя Trp*(САЧ+ЦИК)ОсаждениеиотделениеЦИКизбезглобулиновойплазмысприменением ПЭГ-6000 было проведено с помощью методики [155].80 мкл 24% раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000; Panreac, Испания)добавляли к 420 мкл плазмы крови и инкубировали в течение 15 минут.Затем отделяли осадок центрифугированием в течение 10 минут при 450g.

Вотделенный супернатант добавляли еще 40 мкл 24% ПЭГ-6000, полученныйосадок отделяли центрифугированием в течение 10 минут при 450g. Изполученного супернатанта отбирали аликвоту 100 мкл для определения ДОА.Полученные осадки ЦИК растворяли в 500 мкл 100 мМ фосфатногобуферногораствора(рН7,4)иотбиралиаликвоту30мклдляспектрофлуориметрии.Определяли показатель Trp*(САЧ+ЦИК) = I*trp реал/I0 trp теор, где I*trp реал –реальная измеренная флуоресценция раствора при λfl=353 нм (флуоресценциятриптофана), а I0trp теор– флуоресценция, рассчитанная теоретически спомощью уравнения градуировочной зависимости, полученной для САЧ(Ifl=f(с(САЧ)), y = (0,92 ± 0,05)с + (4,8±0,1), где с – концентрация альбумина,измеренная биохимическим методом. Этот показатель отражает суммарный53уровень триптофановой флуоресценции плазмы крови и, следовательно,уровень ЦИК и альбумина, содержащие в своем составе наибольшееколичество триптофановых остатков.Оценка функциональной активности фагоцитов крови методомлюминол-активированной хемилюминесценции [156]В данном исследовании использовали методику оценки функциональнойактивности нейтрофилов и моноцитов в цельной крови, основанную нарегистрации свечения клеток, подвергнутых последовательной стимуляциидвумя веществами с разным механизмом действия.

На первом этапепроводили предварительную стимуляцию клеток ФМА с внутриклеточныммеханизмом действия. На втором этапе на клетки воздействовали основнымстимулом – ФМЛФ, активация клеток при этом осуществляется благодаряувеличению в них концентрации кальция, поступающего из внеклеточнойсреды. Двойная стимуляция обеспечивает максимально полный ответфагоцитирующих клеток и, следовательно, улучшает точность получаемыхрезультатов.В кювету, содержащую раствор Хенкса, стабилизированный HEPES (2[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновая кислота, Sigma-Aldrich,США) и люминол в конечной концентрации 45 мкМ, добавляли цельнуюкровь, отобранную в вакутайнеры с гепарином, в конечной концентрации4,5% (45 мкл на 1,000 мл раствора в кювете) и регистрировали спонтаннуюхемилюминесценцию в течение 12 минут, затем проводили стимуляциюФМА (конечная концентрация в кювете 50 нг/мл; Sigma-Aldrich, США).После20минутконцентрация10инкубациимкМ;добавлялиSigma-Aldrich,стимулФМЛФСША)и(конечнаярегистрировалииндуцированный хемилюминесценцией ответ в течение не менее 60 мин(Рис.

2).I(ХЛ) *103, имп/с54Основная стимуляция938765421A13+ФМА21Aсп0010+ФМЛФA2AФМА20304050607080время, минРисунок 2. Типичная кривая кинетики реакции ХЛ в ответ на двойнуюстимуляцию нейтрофилов: (1) — спонтанная ХЛ, (2) — предварительнаястимуляция ФМА, (3) — основная стимуляция ФМЛФ. Стрелкамиобозначены моменты добавления стимулов [153].С помощью данной методики можно оценить радикал-продуцирующуюспособность всех фагоцитирующих клеток крови, в том числе моноцитов.

Вдальнейшем,дляпростотыизложения,будутупоминатьсятольконейтрофилы, поскольку их вклад в продукцию свободных радикаловпреобладает.Анализировали следующие параметры, полученные при регистрациикривой развития ХЛ в ответ на двойную стимуляцию нейтрофилов:1) удельную пиковую активность нейтрофила (А1*, амплитуда ФМЛФиндуцированной ХЛ А1, делённая на число нейтрофилов),2) удельную интегральную активность нейтрофила (S*, светосуммавспышки ФМЛФ-индуцированной ХЛ за 30 минут после добавления ФМЛФ,делённая на число нейтрофилов),3) коэффициент затухания респираторного взрыва (Kd = A2/A1, где А1 —амплитуда ФМЛФ-индуцированной ХЛ, А2 — интенсивность ФМЛФиндуцированной ХЛ на 23-й минуте после добавления ФМЛФ),554) удельный уровень спонтанной ХЛ (Асп*, базальная радикалпродуцирующая активность нейтрофила).Воздействие естественными стимуламиБыл проведён ряд экспериментов для изучения радикал-образующейспособности нейтрофилов после воздействия некоторых естественныхстимулов: нейпоген (филграстим, стимулятор лейкопоэза, Хоффман – ЛяРош Лтд., Швейцария, разведение до нужной концентрации проводили 0,5%растворомглюкозы),пирогенал(иммуностимулирующийпрепаратбактериального происхождения, липополисахарид, выделенный из бактерийSalmonella typhi, НИИЭМ им.

Н.Ф.Гамалеи РАМН, Россия), беталейкин(рекомбинантный интерлейкин-1 бета – ИЛ-1β), лиофилизат растворяли в0,9% растворе NaCl, ГосНИИ ОЧБ ФМБА ФГУП, Россия). Конечныеконцентрации стимулов составили: 4,0 нг/мл, 50 мкг/мл и 0,80 мкг/мл дляИЛ-1β, филграстима и пирогенала, соотвественно.2.4 Статистическая обработка данныхСтатистическуюобработкуданныхпроводилиспомощьюпрограммного пакета STATISTICA 13.1 (StatSoft, США).Для проверки гипотезы о нормальности распределения данныхприменяликритерийШапиро-Уилка(p>0,05).Длянормальногораспределения результаты представлены в виде среднего и стандартногоотклонения (s).